3-氨基苯甲酰胺联合顺铂抑制骨肉瘤细胞生长的作用

郑亚东，徐西强，彭飞，虞冀哲，吴华

(华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，武汉 430030)

骨肉瘤是儿童及青少年最常见的骨原发性恶性肿瘤，其恶性程度、致残率、致死率高。20世纪70年代以前，对骨肉瘤患者进行包括截肢在内的局部治疗，总体生存率10% ～20%。随着化学治疗(化疗)水平逐渐提高，骨肉瘤患者的长期生存率得到明显改善，对于原发无转移的患者，约70%患者可以获得长期生存［1］。顺铂是骨肉瘤化疗方案中的一线药物，在临床上广泛使用。但是近来化疗耐药及对化疗不敏感的患者越来越多，骨肉瘤的疗效也停滞不前。聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1［poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1］是一类存在于所有哺乳动物细胞及大部分真核细胞中催化聚ADP核糖化的细胞核酶，其参与的聚ADP核糖化是真核细胞中蛋白质翻译后的重要修饰方式，PARP-1在DNA修复和细胞凋亡中发挥至关重要的作用［2］。3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide，3-AB)是一种有效的PARP-1抑制药，笔者在本研究拟探讨3-AB联合顺铂对人类骨肉瘤细胞U2OS生长的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料 骨肉瘤细胞U2OS购于武汉博士德生物工程有限公司，3-AB为Enzo生物化学公司产品，Cell count kit-8为碧云天公司产品，碘化丙啶(propidium iodide，PI)，RNase 购于 Sigma 公司，McCoy＇s 5 α Medium Modified培养基购于Sigma公司，胎牛血清购于Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人骨肉瘤细胞U2OS细胞用含10%胎牛血清的McCoy＇s 5αMedium Modified培养基培养，每3 d换液1次，待细胞铺满瓶底 ＞80%时，0.25%胰酶消化，按1∶3的比例传代。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖 将U2OS细胞按每孔3 000个的密度种于96孔板，接种两块板，为单纯顺铂处理板和顺铂联合3-AB处理板，单纯顺铂处理板分为7组，分别为①组:空白组，不加细胞，②组:阴性对照组，细胞加完全培养基，③～⑦组:细胞培养基中分别加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μg·mL-1顺铂溶液。顺铂联合3-AB处理板同样分为7组，①②组同前，而分别在上述③～⑦组中再加入15 mmol·L-13-AB，以上所有组均设5个复孔，刺激48 h，然后按照CCK-8说明书操作，酶标仪450 nm波长测定吸光度(A值)。设阴性对照组细胞存活率为100%，按照如下公式计算细胞存活率:存活率(%)=(加药组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期 将U2OS细胞按每皿5×104个密度种于直径6 cm的培养皿中，接种12个皿，分为4组，①组为阴性对照组，予以完全培养基培养，②组为3-AB处理组，培养基中加入10 mmol·L-13-AB，③组为顺铂处理组，培养基中加入3μg·mL-1顺铂溶液，处理6 h后换完全培养基继续培养，④组为3-AB联合顺铂处理组，培养基中加入3μg·mL-1顺铂溶液，处理6 h后换含10 mmol·L-13-AB的完全培养基继续培养，每组3皿，分别培养24，48，72 h后，收集细胞，预冷的80%乙醇固定-20℃过夜，加入PI染液及RNase，室温避光孵育30 min后流式细胞仪检测。

1.2.4 统计学方法 所有数据以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS11.0统计软件处理数据，采用单因素方差分析比较差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制实验 单纯顺铂处理及与3-AB阴性联合处理后细胞的存活率见图1，两组细胞的存活率均随顺铂浓度的增高而逐渐降低。不同浓度及时间3-AB对U2OS细胞的增殖活性的影响之前我们已做过研究，并筛选出刺激后细胞的存活率至少90%的最大耐受浓度及时间，即上述的15 mmol·L-13-AB刺激48 h作为与顺铂联合的浓度及时间，按照文献［3］方法，采用SPSS软件比较顺铂处理组及联合刺激组增殖抑制率达50%时的顺铂浓度，即半数抑制浓度(IC50)，单纯顺铂处理 IC50为1.150 03 μg·mL-1，联合刺激组的IC50为0.652 54μg·mL-1，增敏比为1.76。

2.2 细胞凋亡检测 与阴性对照组比较，经单纯3-AB处理，及3-AB与顺铂联合处理后细胞的凋亡率均增加，而3-AB联合顺铂处理后细胞的凋亡率较单纯3-AB、顺铂处理的凋亡率为高，见图2，提示3-AB加强顺铂对U2OS细胞的促凋亡作用。

3 讨论

顺铂作为常用的化疗药物广泛应用于临床，但是存在肾毒性、严重的呕吐发应和神经毒性等不良反应，以及内在性和获得性耐药限制其应用［4］。近年许多研究者应用其他药物与顺铂联合来加强顺铂的疗效，减少其副作用和耐药性。PARP-1抑制药则是其中研究较多的一种。

1963年法国斯特拉斯堡Mandel小组发现肝细胞核中尼克酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)促进已标记的ATP合成一种难溶于酸的片段［5］，后被研究者证实为聚腺苷酸二磷酸核糖，并从肝细胞核中提取一种新的酶，即PARP。PARP参与DNA修复及转录调控，被认为在细胞生存及死亡中发挥重要调控作用，并参与肿瘤发生及炎症反应过程中转录因子的调节［6］。

多项体外及体内研究证实抑制PARP-1的功能可以加强多种肿瘤细胞对顺铂的敏感性，如MIKNYOCZKI等［7］研究发现 PARP-1抑制药 CEP-6800在体外加强顺铂对Calu非小细胞型肺癌细胞的作用，并增强顺铂对荷瘤裸鼠的治疗效果;DONAWHO等［8］研究表明PARP抑制药ABT-888增强顺铂对乳腺癌裸鼠移植瘤模型的治疗效果。

本实验结果表明，PARP-1抑制药3-AB与顺铂联合较单独应用顺铂对骨肉瘤细胞U2OS抑制作用增加，增敏比为1.76，证实3-AB可以加强U2OS细胞对顺铂的敏感性;运用流式细胞术检测了联合组和单纯顺铂组的细胞凋亡率，证实联合组U2OS细胞的凋亡率高于单纯顺铂组，而细胞周期分析的结果显示3-AB与顺铂联合组较单纯顺铂组细胞周期阻滞于S期的时间更长，研究表明［9-10］，当细胞遭受DNA损伤时，细胞通过一系列调节机制抑制细胞周期进行，抑制DNA复制，阻止细胞的分裂，为DNA修复系统提供时间进行DNA修复，若修复成功，细胞继续进行或完成下一个细胞周期事件，若修复不完全或不能修复，细胞则发生凋亡。笔者推测，顺铂引起骨肉瘤细胞DNA损伤，细胞周期停滞，而同时应用3-AB则抑制了DNA修复过程，导致细胞阻滞于S期的时间更长，而DNA修复受到抑制，导致凋亡增加。

综上所述，PARP-1抑制药3-AB能增强骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性，增强顺铂对骨肉瘤细胞的促凋亡作用，本研究结果为进一步应用PARP-1抑制药为化疗增敏剂提供了初步依据。

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