生物荧光成像用分子与纳米探针

李世琴，安文汀，李荣霞，赵俊红，焦勇

（山西大学分子科学研究所，太原 030006）

1 引言

生物成像是一个多学科交融、多技术集成、发展迅速、应用广泛的新兴领域。以核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)和计算机体层摄影(Computed Tomography,CT)为代表，生物医学成像在临床诊断上发挥着不可替代的重要作用［1］。

生物荧光成像是近年来发展较快、引人瞩目的生物成像方向之一。荧光技术因其快捷、灵敏、重复性好、无放射性，多个光物理参量（如激发波长、发射波长、荧光强度、荧光寿命、发射各向异性）可用于检测等优点，在生命科学研究中获得了广泛应用［2-3］。荧光探针是生物荧光成像的核心技术之一。目前为止，荧光探针可大体上分为：（1）化学类：有机染料，纳米材料（含半导体量子点、上转换稀土纳米粒子、贵金属粒子、纳米钻石等），以及金属配合物（含稀土配合物）等；（2）生物类：藻胆蛋白，基因编码荧光蛋白 （如Green Fluorescent Protein,GFP）， 分子灯标（Molecular Beacon，一类发卡结构的寡聚核苷酸荧光探针）等。本文仅对目前应用最为广泛的有机染料和研究最为活跃的半导体量子点及上转换稀土纳米粒子等化学类荧光探针，从发光机制、设计发展策略、合成制备方法以及生物成像应用实例等方面，予以简要评述。

2 生物成像用荧光探针的一般属性

一般地，适用于生物成像的荧光探针须具备以下性质：

（1）光物理性质：便于激发和检测，不会与生物基质同时被激发，生物背景干扰小；较高的摩尔消光系数和荧光量子产率；

（2）化学性质：在相关缓冲液、细胞培养液或体液中较好的溶解性；使用条件下的热、光稳定性；标记的位点特异性；

（3）生物相容性：标记所带来的立体或尺寸相关的干扰效应要尽量小；易于进入细胞；标记的生物毒性小。

3 有机染料

有机染料是目前应用最为广泛的一类荧光探针。有机染料的光物理性质取决于其分子的电子跃迁类型：（1）离域于整个发色团的共振跃迁，相应的染料称为共振染料；（2）分子内电荷转移跃迁，相应的染料称为电荷转移染料。依据结构－性质关系，可以通过精心的设计策略实现对发光性质的精细调控。大多数常见荧光探针，诸如荧光素类、罗丹明类、大多数的氟 硼荧类 （Boron-dipyrromethene,BODIPY）和花菁素类，都属于共振染料。其特征是：相对较窄的、通常互为镜像的吸收和发射带；溶剂极性不敏感的、较小的Stokes位移；高的摩尔消光系数；中等或高的荧光量子产率。然而，吸收和发射光谱的有限的分离，使得不同染料之间的相互干扰不易避免。相反地，电荷转移染料，例如香豆素类，在极性溶剂中则具有分离较好的、较宽的吸收和发射带，较大的依赖于溶剂极性的Stokes位移。然而，摩尔消光系数和荧光量子产率通常较共振染料为之低。

有机染料类荧光探针的设计发展策略多种多样。其中一种常见的设计发展策略就是基于某一类母体结构而不断修饰、功能化的衍生策略。以罗丹明类染料为例，就是以氧杂蒽为母体结构而发展起来的一类碱性染料。早在三十年前，具有强红色荧光的磺化罗丹明B和磺化罗丹明101衍生物就与荧光素连接在一起，被用于双信号或多信号的荧光分析检测［4-5］。此后，Lefevre等［6］利用6-氨基己酸将磺化罗丹明B和磺化罗丹明101衍生物连接起来，提高了荧光特性，使之更适于荧光标记。Nagano等［7］开发了一种基于罗丹明发色团的NO荧光探针，550nm激发，检测限7nm，已成功用于活细胞的NO荧光成像。近来，复旦大学李富友等［8］发展了一种罗丹明类荧光染料，利用Cu2+与氧、硫原子的配位作用而引起罗丹明结构发生变化，实现Cu2+的胞内外检测。

另一种设计发展策略可称为靶标导向策略。例如，活性氧物种（Reactive Oxygen Species,ROS）荧光探针是近年来有机荧光探针的研究热点之一。ROS与生命体的健康、老化和疾病都有密切关系。线粒体是细胞内氧气的主要消耗者，是ROS的主要源头，在ROS的生物学研究中居于中心地位。线粒体靶向的ROS荧光探针为揭示ROS的生化奥秘可提供高时空分辨率的强有力工具。线粒体靶向的ROS荧光探针的设计策略是：从功能要求出发，结构上由两部分组成：（i）靶向载体部分，定向输运分子到线粒体；（ii）高选择性、特异性的分子开关部分，与特定ROS作用后，点亮荧光。例如，Chang等［9］报道了一例这类探针MitoPY1。它以亲脂性阳离子三苯基膦（Triphenylphosphonium,TPP）基团为靶向线粒体的分子载体。靶向机理是，由跨线粒体内膜的质子梯度所形成的负电势，可以使阳离子基团通过静电作用定位于线粒体。分子开关部分机理是由硼酸基团选择性地与H2O2反应，打开罗丹明的闭环结构，从而形成大共轭体系而产生荧光。Guo等［10］报道了一种H2O2和氧还金属离子 “串连双开关模式”的荧光探针，即只有在一定浓度的H2O2存在的前提下 （开关1），同时存在氧还金属离子（开关2），荧光探针才会被 “点亮”。这种荧光探针在细胞的氧化胁迫状态（H2O2水平）的实时检测，以及活体组织的抗Fenton反应方面有较大应用潜力。

利用有机染料标记蛋白质等生物大分子，进而利用多种荧光成像手段研究被标记物种的跨膜行为，胞内分布，与特定细胞器的共定位，信号转导路径，以及生理及病理效应等活细胞荧光成像分析，在分子生物学、生理学和病理学研究领域越来越成为一种直观有效的研究模式。

简言之，有机染料分子小、结构简单、可以快速通过很多生物屏障，且商品化的分子较多，在体内外荧光成像、DNA自动测序、抗体免疫分析、抗癌药物开发、疾病诊断等方面应用广泛。但一般而言，其光化学稳定性较差，易于光漂白和降解；Stocks位移较小，易于受到干扰而降低检测灵敏度；荧光寿命在细胞和组织内停留时间较短，较难以实现长时间的实时动态信号追踪，使其在生物医学领域的应用受到了一定限制。

4 半导体量子点

半导体量子点（Quantum Dots,QDs）是一类由Ⅱ-Ⅵ或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的、粒径小于或接近激子波尔半径的纳米粒子。其光物理性质表现出显著的量子限域效应（Quantum Size Effect,QSE），即荧光的吸收和发射性质依赖于粒径大小，随着粒径减小而蓝移。半导体量子点具有以下独特的光谱性质：（1）“宽激发，窄发射”，即激发波长范围宽而发射波长范围窄，因而可用同一波长同时激发多种量子点而获得多色荧光；（2）发射峰较窄，峰形对称，重叠小；（3）量子限域效应显著，可以通过调节粒径和组成来实现发射波长的调控；（4）荧光强度较高、稳定性及抗光漂白能力较强，便于对标记物进行长期、实时跟踪观察；（5）经表面修饰后，生物兼容性好，易于进行特异性连接，进而进行生物活体标记和检测；（6）双光子截面较大，可在较低激发强度下进行活体的深层组织成像。基于上述特点，近年来量子点在生物分子检测、细胞和活体多色标记成像、正常及病变组织的定位和成像等领域的应用得到了快速发展。

量子点有多种合成方法，包括溶胶凝胶法、气相沉积法、电化学沉积法和微乳液法等。早期由气相沉积法制得的量子点粒径分布宽，量子产率低。近年来研究发现，溶胶法制备的量子点具有很好的发光性能，成为目前应用最广泛的制备方法。溶胶法分为有机相法和水相法两种。尽管有机相法制备的量子点具有结晶性好、尺寸均一、粒度可调等优点，但该方法条件苛刻，原料昂贵，毒性大，易燃易爆，且制得的量子点在空气中不稳定性，特别是纳米晶表面通常包覆着憎水性基团，限制了其在生物成像的应用。比较而言，水相法有很多优点，如操作简单、毒性小、成本低，最突出的就是可以根据需要直接设计成生物探针，无需进一步修饰。近年来发展的高温水热法和微波辅助水热法等进一步提高了量子点的相关性能。我们实验室主要采用水热法合成水溶性CdTe/CdS壳核量子点，并将其应用于活细胞荧光成像。

量子点进一步与抗体或靶向性的小分子配体相偶联，可用于细胞或亚细胞结构的特异性标记。1998年，Alivisatos等［11］报道了量子点的生物标记，初步解决了量子点的水溶性及与生物分子偶联问题。Zhao等［12］利用细胞核特异性染料Hoechst 33342的“分子向导”作用，将其与水溶性CdTe量子点以非共价形式偶联起来，成功地将量子点定位于活细胞的核酸负电骨架上。庞代文等［13］开展了基于量子点的荧光免疫技术研究，同时对乳腺癌的HER2和ER细胞进行了双色荧光成像。张春阳等［14］利用双光子扫描荧光显微镜，观察、验证了量子点标记的天花粉蛋白以受体介导的内吞方式进入人绒癌细胞的机理，及其在细胞内的分布。此外，用量子点标记前列腺特异性膜抗原（PSMA）的抗体，经小鼠尾静脉注射，实现了对表达PSMA的前列腺癌的靶向成像［15］；量子点偶联曲妥单抗，被成功地用于KPL-4荷瘤裸鼠中Her2的成像研究，在活体中观察到量子点从血管逐步移入细胞核的整个过程［16］。

尽管QDs的应用研究非常广泛，但目前仍面临诸多挑战：粒径均一化控制较难，表面缺陷较多，影响发光稳定性；生物标记时多个生物分子会同时连接在量子点上，难于控制生物分子的取向、可能发生团聚；生物毒性问题等。另外，荧光的非单指数型衰减行为，使之不适用于时间分辨的荧光检测。

有机染料和量子点的发光机制是光子能量损失的下转换过程，即发射波长较激发波长为之长 （红移）。当用紫外或蓝光激发时，其在生物成像上所面临的突出问题就是生物组织自体荧光产生的背景干扰。稀土上转换纳米粒子（Upconversion Rare Earth Nanoparticles,UCRE-NPs）有望克服这一难题。其发光机制是稀土纳米粒子吸收两个或多个低能光子而辐射一个高能光子的上转换过程，即发射波长比激发波长短的反Stokes发光。利用稀土上转换纳晶的这一独特优势，以近红外或红外光为激发源，荧光成像时可大大降低或消除自体荧光干扰、提高信噪比和检测灵敏度。同时，近红外光还具有对生物组织几乎无损伤的、高达十数厘米的穿透力。因而，近年来近红外光激发－可见光发射的稀土上转换纳米粒子激起了人们越来越浓厚的研究兴趣。

稀土上转换纳米材料的制备方法主要有热分解法、水热溶剂热法、共沉淀法和溶胶凝胶法等。稀土氟化物是目前多种稀土上转换纳米材料中发光效率较高、应用较多的一种。热分解法的典型步骤是，将预先制备好的三氟乙酸稀土盐添加到高沸点有机溶剂（油酸、油胺等）中，氮气保护下升温至250-340℃，使三氟乙酸稀土盐热分解生成稀土氟化物纳米晶体。北京大学严纯华等［17］利用热分解方法制备了单分散的LaF3三角纳米盘，随后通过改变温度、加热时间等条件，制备了各种形貌可控的不同晶相的稀土荧光纳晶。稀土上转换纳米粒子的粒径一般较大，通常在十几、几十或上百纳米。为了使标记物更小、更稳定，近来Chen等［18］由热分解法制备了粒径7－10nm的上转化NaYF4:Yb3+/Tm3+/Ho3+纳晶，近红外激发和发射，被称为“生命组织的透明观察窗”。清华大学李亚栋等［19］利用水热合成法合成了形貌各异、粒径可调的单分散纳米晶体。

在制备得到结晶度好、掺杂均匀、粒径均一、单分散性的稀土纳晶后，为了适用于生物成像，需要进一步通过表面改性（如二氧化硅/聚合物包覆、配体交换/氧化）和靶向性修饰，使纳晶具有良好的水溶性以及一定的靶向选择性。Wang等［20］报道了利用固液两相溶剂热法合成NaYbF4上转换纳米粒子，通过调节掺杂稀土离子种类或浓度，实现了在单一近红外波长980nm激发，可发射橙、黄、绿、青、蓝等多色荧光上的转换纳米粒子。通过包覆硅壳层改善水溶性，并联接兔抗－CEA8抗体，实现了活HeLa细胞的免疫标记和荧光成像。

作为新一代荧光探针，稀土上转换发光纳米材料除了具备前述的内禀优势外，还有吸收和发射带窄，Stokes位移大，光、热稳定性好等优点，可以预见其在生物成像方面必将发挥越来越大的作用。

5 结论与展望

基于有机染料的生物成像仍然是目前发展最为成熟的、实用化荧光成像技术。有机染料为人们提供了一种简捷、安全、相对价廉、使用标准化的荧光探针。尽管其光谱特性不是最优的，光化学稳定性也不是最高的，但有机染料以其变化无穷的完全共价构筑的小分子特性，继续拓展着自身的发展空间。

以量子点和上转换稀土纳米粒子为代表的荧光纳米粒子，具有诱人的应用前景。量子点和上转换稀土纳米粒子的突出优点就是可以实现单波长激发下的多色编码，同时检测，从而极大地简化了多色成像。尽管荧光纳米粒子具有独特、优异的光谱性质和稳定性，但要在生物成像上真正实用化，还要进一步发展表面修饰技术，提高水溶性、表面包覆的稳定性、生物相容性和靶向性，并降低生物毒性。随着研究的深入，新兴的纳米荧光探针在生物成像上将会发挥更大的作用。

毋庸置疑，生物成像用荧光探针是一个生机勃勃、充满挑战的领域。面对生命系统的复杂性，不存在通用的荧光探针工具。只有尽可能地研究开发更多种类的荧光探针才有可能满足多方面的需求。不难预测，各类荧光探针的未来格局是，性能互补，共同发展，为生物成像提供更大的可选择空间。

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