弥漫性脑损伤大鼠皮质和海马中BrdU和Nestin蛋白的表达

韩宁娟，张孝刚，杨 静，张文娟，刘光旭，郭淑香，杨 波，张广政#

1)郑州大学基础医学院法医学教研室郑州 450001 2)郑州市公安局刑侦支队郑州450004 3)郑州大学第一附属医院神经外科郑州 450052

#通讯作者，男，1963年7月生，博士，副教授，研究方向:法医临床与司法精神病学，E-mail:zgz@zzu.edu.cn

弥漫性脑损伤大鼠皮质和海马中BrdU和Nestin蛋白的表达

韩宁娟1)，张孝刚2)，杨 静1)，张文娟1)，刘光旭1)，郭淑香1)，杨 波3)，张广政1)#

1)郑州大学基础医学院法医学教研室郑州 450001 2)郑州市公安局刑侦支队郑州450004 3)郑州大学第一附属医院神经外科郑州 450052

#通讯作者，男，1963年7月生，博士，副教授，研究方向:法医临床与司法精神病学，E-mail:zgz@zzu.edu.cn

弥漫性脑损伤;5-溴-2-脱氧尿苷;巢蛋白;损伤时间;大鼠

目的:观察大鼠弥漫性脑损伤(DBI)后不同时间皮质和海马中5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)和巢蛋白(Nestin)蛋白的变化，探讨其与脑损伤时间的关系。方法:成年健康SD大鼠36只，随机分为对照组(6只)和实验组(30只)。实验组大鼠制作DBI模型后用免疫组织化学方法观察脑损伤后不同时间(1、3、7、14和28 d，n=6)皮质和海马中BrdU和Nestin蛋白的表达。结果:与对照组相比，实验组大鼠DBI后不同时间脑皮质、海马中的BrdU及Nestin阳性细胞均增加(BrdU:F皮质=141.447，F海马=48.361，P均＜0.001;Nestin:F皮质=94.159，F海马=98.183，P均＜0.001)。伤后1 d，皮质和海马内就有BrdU和Nestin阳性细胞的大量表达;皮质内BrdU阳性细胞的表达于3 d达到高峰，Nestin阳性细胞的表达于7 d达到高峰，均持续至第14天后开始下降;海马内BrdU和Nestin阳性细胞的表达于第7天达到高峰，其后逐渐下降。结论:BrdU和Nestin蛋白表达所呈现出的时序性变化规律，可望用于DBI损伤时间的推断。

闭合性弥漫性脑损伤(diffuse brain injury，DBI)是法医实践经常遇到的一种颅脑损伤，这种类型的脑损伤无集中的脑挫伤表现，病理形态改变无明显的时序性变化，需要寻找与其损伤相关的生物学指标来帮助推断损伤时间。目前，国内法医病理学者［1］对特异性蛋白在脑损伤后的变化规律有部分研究，但对DBI的研究较少。作者观察了大鼠DBI后不同时间内皮质和海马中5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)和巢蛋白(neuroepthelial stem cell protein，Nestin)表达的变化，探讨其与脑损伤时间的关系，为DBI时间的鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 成年健康SD大鼠36只，雌雄不限，体质量(250±20)g，由河南省实验动物中心提供。随机分为对照组(6只)和实验组(30只)。实验组根据伤后不同时间取材，分为损伤后1、3、7、14和28 d组，每组6只。所有动物室温饲养，自由进食水。

1.2 动物模型的建立 实验组大鼠按改良的Marmarou法［2］制作DBI模型:用10 g/L戊巴比妥钠腹腔注射(30 mg/kg)麻醉后，将其俯卧固定于已知厚度及弹性系数的海绵床上，用一特制铁头盔套于头顶，头盔中央对准打击管下口。待动物开始苏醒，略有肢体活动时，用450 g铁棒从1.5 m高度自管内自由坠落至特制头盔正上方，立即移开海绵床以免二次损伤。观察打击中及打击前后动物呼吸、肢体活动及神经体征的变化。对照组不予任何特殊处理，直接断头处死。

1.3 大鼠脑组织皮质和海马内BrdU及Nestin的免疫组织化学检测 所有实验动物处死前1 d腹腔注射BrdU，共3次，每4 h 1次，每次50 mg/kg。各组大鼠于相应时间点处死后经心脏灌注肝素化生理盐水10 min，然后用40 g/L多聚甲醛快速滴注20 min。心脏灌流后断头取脑组织，在大脑正中处作冠状切面，取材厚度约5 mm，40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片厚度4 μm，分别进行常规HE染色、BrdU和Nestin免疫组织化学染色。用PBS代替一抗作阴性对照，使用已知阳性切片作阳性对照。鼠抗Brdu单克隆抗体、兔抗鼠Nestin多克隆抗体和即用型SP免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统，高倍视野下，每张切片选取4个不同视野(共计数200个细胞)，分别对BrdU和Nestin阳性细胞(胞核内着棕黄色颗粒且密度不均者为Brdu阳性细胞;细胞呈三角形或梭形、胞质呈棕黄色为Nestin阳性细胞)进行阳性细胞计数。

1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0进行统计分析，先对每组数据作正态性检验，再作方差齐性检验。应用单因素方差分析及LSD-t检验比较大鼠DBI后不同时间海马和皮质BrdU、Nestin阳性细胞数的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 实验组大鼠受打击后，多数出现即刻昏迷症状(听觉反射、痛觉反射和角膜反射均消失)，呼吸暂停数秒至数十秒，自主呼吸出现后由快到慢;大多动物出现竖毛现象和数十秒甚至更长时间的全身痉挛;完全苏醒后以上症状会逐渐好转，但普遍出现反应迟钝、活动和进食减少的现象。

2.2 大鼠脑组织病理学变化 见图1。实验组损伤呈全脑弥漫性分布，损伤早期(第1天)脑实质内可见出血点;神经元肿胀，体积增大，核膜不清，周围出现空隙;毛细血管扩张充血，炎症细胞附壁。损伤后3 d可见脑组织疏松，神经元周围出现较多间隙，胶质细胞反应性增生，损伤血管周围可见大量淋巴细胞和单核巨噬细胞聚集。对照组未见明显改变。

2.3 大鼠DBI后不同时间BrdU、Nestin阳性细胞数的变化 对照组大鼠大脑皮质和海马存在少量BrdU阳性细胞，散在分布，呈弱阳性;Nestin在海马区低水平表达，在皮质内无表达。实验组大鼠脑皮质和海马BrdU、Nestin阳性细胞增多。见图2、表1。

表1 大鼠DBI不同时间BrdU和Nestin阳性细胞数的变化 个

3 讨论

BrdU是胸腺嘧啶核苷的类似物，当细胞处于DNA合成期时，掺入到新合成的DNA中，可作为增殖细胞的标记物。理论上，损伤后BrdU标记的增殖细胞可能与进入凋亡细胞的BrdU及参与DNA修复的BrdU相混淆，但Moore等［3］研究发现BrdU仅在神经发生时可检出，在DNA修复峰期不能被检出，所以可以用BrdU来观察新生细胞的增殖变化。作者研究发现，脑损伤后1 d后，皮质内BrdU阳性细胞显著增加，3 d后达到高峰，一直持续到14 d后逐渐下降，至28 d后仍高于正常水平;脑损伤1 d后，海马内BrdU阳性细胞数较对照组显著增加，至7 d后达到高峰，14 d后开始明显下降，至28 d仍高于正常水平。从这一系列变化中也可以看出脑损伤后BrdU表达水平变化呈一定的时程规律性。

Nestin是一种胚胎时期表达的第Ⅵ类中间丝蛋白，为神经干细胞的标志物之一，主要存在于胚胎时期的中枢神经系统，胚胎晚期随着干细胞的分化成熟，逐渐被胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白等中间丝蛋白所代替。在机械性脑损伤、脑缺血及兴奋性毒性脑损伤等应激刺激下，神经细胞可出现胚胎期的逆转，特异性及一过性地表达Nestin蛋白［4］。屈建强等［5］研究发现在大鼠脑挫伤后Nestin的表达具有一定的时序性。作者的研究结果显示大鼠DBI后1 d，皮质内Nestin阳性细胞开始显著增加，3 d后达到高峰，持续至14 d，损伤后28 d明显下降，但仍高于对照组;海马区Nestin阳性表达的细胞数在损伤后1 d后明显增加，7 d后达到高峰，一直持续至损伤后14 d。此结果与Chen等［6］的研究有所不同，与Urbach等［7］的研究结果基本一致。Chen等［6］研究发现脑损伤后神经前体细胞在伤后28 d恢复到对照组水平，Urbach等［7］发现脑损伤后神经前体细胞增殖可持续至损伤后6周。以上结果有所不同可能与所选动物种属、月龄或损伤模型不同有关。

Nestin阳性细胞可以看作是神经干细胞，BrdU阳性细胞可以看作是增殖细胞，所以Nestin阳性细胞和BrdU阳性细胞的多少，也可以从一个方面反映DBI后大脑的自我修复能力的强弱。该研究结果显示在正常成年大鼠脑组织中仅少数部位存在少量的Nestin和BrdU阳性细胞，DBI后脑组织内Nestin和BrdU阳性细胞明显增加，并且随时间变化有一定的时序性，提示其可能为判断脑损伤时间提供一种新的指标。在DBI发生后不同的时间段内，由于它们具有灵敏性和时序性优点，从而便于对它们进行检测观察，所以其对DBI的诊断具有一定的参考价值。Nestin阳性细胞和BrdU阳性细胞的变化具有一定的趋势性，如能进一步研究出Nestin和BrdU增殖趋势的平台期，就可能推断出脑损伤多久后脑细胞不再增殖，从而或许能为脑损伤伤残鉴定的时限提供一定的理论依据。

该研究结果还显示DBI后海马及皮质区BrdU和Nestin阳性细胞的变化虽大体趋势一致，但具体变化不一致，二者结合使用，可为进一步准确推断脑损伤形成时间及大脑损伤的程度提供可能。此外，由于作者现在的研究仅局限于动物模型，如需在人体中加以实际应用尚有待进一步研究。

［1］黄平，刘岩峰，托娅，等.大鼠弥漫性脑损伤后S100β表达与损伤时间关系［J］.法医学杂志，2006，22(1):4

［2］ Marmarou A，Foda MA，van den Brink W，et al.A new model of diffuse brain injury of rats.PartⅠ:pathophysiology and biomechanics［J］.J Neurosurg，1994，80(2):291

［3］Moore N，Okocha F，Cui JK，et al.Homogeneous repair of nuclear genes after experimental stroke［J］.J Neurochem，2002，80(1):111

［4］Shi M，Wei LC，Cao R，et al.Enhancement of nestin protein-immunoreactivity induced by ionizing radiation in the forebrain ependymal regions of rats［J］.Neurosic Res，2002，44(4):475

［5］屈建强，贺西京，杨平林，等.成年大鼠液压冲击脑损伤诱导室下区Nestin和GFAP的表达［J］.西安交通大学学报:医学版，2004，25(5):436

［6］Chen S，Pickard JD，Harris NG.Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury［J］.Exp Neurol，2003，182(1):87

［7］Urbach A，Redecker C，Witte OW.Induction of neurogenesis in the adult dentate gyrus by cortical spreading depression［J］.Stroke，2008，39(11):3064

Expression of BrdU and Nestin protein in cortex and hippocampus of rats with diffuse brain injury

HAN Ningjuan1)，ZHANG Xiaogang2)，YANG Jing1)，ZHANG Wenjuan1)，LIU Guangxu1)，GUO Shuxiang1)，YANG Bo3)，ZHANG Guangzheng1)1)Department of Forensic Medicine，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)Department of Criminal Detection，Police Station of Zhengzhou City，Zhengzhou 4500043)Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

diffuse brain injury;BrdU;Nestin;injury time;rat

Aim:To observe the alteration of BrdU and Nestin positiveness cells in the diffuse brain injury(DBI)rat and its relation to the injury intervals.Methods:A total of 36 healthy adult SD rats were randomly divided into control and experimental groups.Based on Marmarou’s model of DBI and took the samples at 1 d，3 d，7 d，14 d，and 28 d after brain injury.The expressions of BrdU and Nestin were observed by immunohistochemical staining in combination with imaging analysis.Results:Compared with the control group，at 1 day post-trauma，a significant increase in BrdU and Nestin postive cells was observed in the cortex and hippocampus tissue(BrdU:FCortex=141.447，FHippocampus=48.361，P＜0.001;Nestin: FCortex=94.159，FHippocampus=98.18，P＜0.001).The expression level of BrdU peaked at 3 days after injury and Nestin peaked at 7 days after injury in cortex tissue，then they decreased gradully at 14 days after injury.The expression level of BrdU and Nestin peaked at 7 days in hippocampus tissue，then they decreased gradually.Conclusion:Time-order expression of BrdU and Nestin could be used to estimate the time of brain injury in forensic pathology.

DF795.1

(2010-03-12收稿 责任编辑赵秋民)