海洋多粘类芽孢杆菌L1-9菌株50 L发酵罐发酵工艺*

马桂珍，王淑芳，暴增海，吴少杰，夏振强，付泓润

1(淮海工学院海洋学院，江苏连云港，222005) 2(江苏省海洋资源开发研究院，江苏连云港，222005)

海洋多粘类芽孢杆菌L1-9菌株50 L发酵罐发酵工艺*

马桂珍1，2，王淑芳1，暴增海1，2，吴少杰1，夏振强1，付泓润1

1(淮海工学院海洋学院，江苏连云港，222005) 2(江苏省海洋资源开发研究院，江苏连云港，222005)

为了提高海洋细菌L1-9菌株液体发酵的生物量和抑菌活性，进行了50 L发酵罐的分批发酵和补料发酵工艺研究。结果表明:L1-9菌株在50 L发酵罐中分批发酵工艺为:接种量8%(菌龄24 h、浓度为109个细胞/mL)、初始搅拌速度250 r/min、通气量为3 L/min，发酵时间为11～12 h，生物量达2.40×1010CFU/mL;补料分批发酵工艺为:在分批发酵的条件下，发酵13 h开始流加60 g/L葡萄糖溶液，使还原糖浓度保持在0.4 g/L左右，发酵周期30 h，生物量达到4.63×1010CFU/mL，比分批发酵提高了78.07%;抑菌时效测定结果表明，发酵液对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌作用伴随着生物量的增加不断加强，20 h抑菌活性达到高峰，抑菌带宽度为17.75 mm，抑菌活性与生物量呈正相关，为生长关联型。

海洋多粘类芽孢杆菌，生物量，抑菌活性，发酵

多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)中有很多菌株可作为重要的生防资源，用于多种植物病害的生物防治［1－5］，该菌对人畜安全，无环境污染，对植物非致病性，美国环境保护署(EPA)已将其列为可商业上应用的微生物种类之一 ，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。徐玲等将筛选到的多粘类芽孢杆菌菌株HY96-2研制成了0.1×108CFU/g多粘类芽孢杆菌细粒剂(KDLD)，已登记并在生产上应用，它对番茄青枯病具有良好的防效［6］。现已报道的多粘类芽孢杆菌均分离自土壤，而L1-9菌株是分离自连云港海域对植物病原真菌具有抗菌活性的多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)优良菌株，该菌株形态上与已报道的多粘类芽孢杆菌特征一致，但其在海水和淡水配制的牛肉膏蛋白胨培养基上不能生长，而在用海水配制的PDA培养基上生长良好，生长特性与已报道的多粘类芽孢杆菌菌株具有明显不同。该菌株及其发酵产物对小麦雪腐镰刀病菌(Fusarium nivale)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)、玉米圆斑病菌(Helminthosporium carbonum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、细链格孢菌(Alternaria tenuis)、小麦根腐霉病菌(Bipolaris sorokiniana)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)和苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternata)等多种植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发具有强烈的抑制作用［7－9］。该菌株能产生几丁质酶、葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶［10］和抗菌蛋白，具有广阔的开发应用前景。本课题对该菌株在50L发酵罐中的发酵工艺进行研究，为该菌株的进一步开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

海洋细菌L1-9菌株分离自连云港海域，淮海工学院海洋学院海洋微生物研究室保存。活化后备用。供试金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由本院基础微生物实验室保存。

1.1.2 主要仪器

MCGS 50 L自动发酵罐，上海百仑生物科技有限公司;HZQ-F160全温振荡培养箱，舟山市定海区海源仪器厂;CR22G高速冷冻离心机，日本HITACHI公司;754N分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;DHG-9240 A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.1.3 培养基

海洋细菌L1-9菌株活化培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，海水1 000 mL，pH自然。

种子液和发酵培养基(g/mL):豆饼粉1，玉米粉1.5，麦麸 1，大米粉0.5，NaCl 3，KH2PO40.07，MgSO40.03，CaCO30.1，pH 6.5，海水配制。

金黄色葡萄球菌培养及抑菌试验培养基:牛肉膏蛋白胨培养基。

1.2 方法

1.2.1 分批发酵的培养

50 L发酵罐中装30 L发酵培养基，接种量6%，接种种龄24 h，温度28℃，在不同的通气量和初始搅拌速度条件下发酵。根据溶氧需求，调整搅拌速度，使发酵过程溶氧在0.4%以上，同时通过流加10%的氨水溶液控制发酵液的pH，降低发酵液的黏度，增加溶氧。36 h测定生物量和发酵液的抑菌活性。

1.2.2 种子液的制备

L1-9菌株划线接种在PDA斜面上，28℃恒温培养24 h，加入3 mL种子液培养基，用接种环轻轻刮取菌苔，制成均匀的菌悬液，接入装有50 mL种子液培养基的250 mL三角瓶中，28℃、180 r/min摇床培养24 h，作为种子液，调节浓度为109个细胞/mL。

1.2.3 发酵工艺的确定

1.2.3.1 通气量的确定

按1.2.1 的培养方法，设通气量为1、2、3、4、5 L/min，初始搅拌速度为200 r/min，比较不同通气量下的生物量和抑菌活性，以确定最佳通气量。

1.2.3.2 搅拌速度的确定

按1.2.1的培养方法，设搅拌初始速度为150、200、250、300、350 r/min，通气量为 3 L/min，发酵过程中根据溶氧需求调整搅拌速度，比较不同搅拌速度下的生物量和抑菌活性，以确定最佳搅拌速度。

1.2.3.3 接种量的确定

按1.2.1的培养方法，设接种量为2%、4%、6%、8%、10%，初始搅拌速度为200 r/min，通气量为3 L/min，比较不同接种量下的生物量和抑菌活性，以确定最佳接种量。

1.2.3.4 发酵时间的确定

按1.2.1的培养方法，按优化后的接种量和搅拌速度及通气量进行发酵，每隔2 h取样测定生物量和发酵液抑菌活性，以确定最佳发酵时间。

1.2.4 补料发酵的发酵工艺

按照优化后的分批发酵工艺，当葡萄糖浓度低于4 g/L时，根据糖消耗量/h，多次补入适量60 g/L葡萄糖溶液，补加速率与糖消耗速率相等，使还原糖保持在4 g/L。发酵前期pH值控制在6.3左右，发酵后期pH保持自然。比较分批发酵和补料发酵的生物量和抑菌活性。

1.2.5 发酵液中残糖含量的确定

在最适培养条件下发酵培养细菌，每隔2 h取样，采用DNS定糖法测定细菌发酵液残糖含量。

1.2.6 生物量的测定

采用平板菌落计数法。

1.2.7 抑菌活性测定

采用牛津杯法。指示菌为金黄色葡萄球菌(S.aureus)。发酵液12 000 r/min，4℃下离心30 min，上清液用0.22微孔滤器除菌。

2 结果与分析

2.1 最佳通气量的确定

通气量对L1-9菌株发酵的影响结果见表1。

表1 通气量对L1-9菌株生物量和抑菌活性的影响

由表1可见，通气量对L1-9菌株生物量和抑菌活性有显著影响，1～3 L/min范围内，随着通气量增加，生物量和抑菌活性增加;通气量为3 L/min时，生物量和抑菌活性均达到最高;高于4 L/min，生物量和抑菌活性逐渐下降。适当增加通气量可以提高生物量和抑菌活性，表明海洋细菌L1-9菌株为好氧菌。

实验中发现，发酵后期发酵液黏度加大，通气量越大，发酵液黏度加大越早，通气量高于4 L/min，生物量和抑菌活性却逐渐减少。这可能是因为高通气量促进细菌在生长，同时由于菌体数目的增加，细胞荚膜多糖的大量形成，增加了发酵液的黏度，减少了发酵液中的溶氧，抑制了细菌的生长［11］。

2.2 最佳搅拌速度的确定

搅拌速度对L1-9菌株发酵的影响结果见表2。

表2 搅拌速度对L1-9菌株生物量和抑菌活性的影响

由表2可见，搅拌速度对L1-9菌株生物量和抑菌活性有显著影响。搅拌速度在150～250 r/min范围内，随着搅拌速度的增加，生物量和抑菌活性增加，搅拌速度为250 r/min时，生物量和抑菌活性均达到最高，搅拌速度高于250 r/min，生物量和抑菌活性逐渐下降。

实验中发现，搅拌速度高于200 r/min时，发酵罐内形成泡沫较多，会导致发酵液外溢。

2.3 最佳接种量的确定结果

接种量对L1-9菌株发酵的影响结果见表3。

表3 接种量对L1-9菌株生物量和抑菌活性的影响

由表3可见，接种量对L1-9菌株生物量和抑菌活性有显著影响。接种量在2% ～8%，随着接种量的增加，生物量和抑菌活性增加，接种量为8%时，生物量和抑菌活性均达到最高，接种量为10%时生物量和抑菌活性有所下降。

从表1、表2和表3的结果可以看出，该菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌作用与生物量呈正相关。

2.4 最佳发酵时间的确定

按接种量为8%，初始搅拌速度为250 r/min，通气量为3 L/min，进行发酵，培养时间对发酵的影响情况见图1。

图1 L1-9菌株分批发酵生物量和残糖变化曲线

由图1可见，多粘芽孢杆菌L1-9的生长阶段如下:第1阶段，0～6 h，处于延滞期，菌体生长缓慢;第2阶段，6～10 h，生物量迅速增加，处于对数生长期，实验中观察发现发酵液逐渐变黏稠，溶氧一直低于10%;第3阶段，10～18 h，生物量增加缓慢，菌体浓度在18 h达到最大，为2.60×1010CFU/mL，但与11～12 h生物量2.40×1010CFU/mL变化较小，处于稳定期;18 h以后，生物量开始下降，进入衰退期，显微镜观察到芽孢逐渐形成。在实际生产中为了减少动力消耗，选择11～12 h作为该菌株分批发酵的最佳时间。

2.5 L1-9菌株分批发酵工艺及其还原糖变化

按优化后的发酵条件接种量8%、初始搅拌速度250 r/min、通气量为3 L/min，进行发酵不同培养时间菌株L1-9的生物量和还原糖量见图1。

由图1可见，发酵2h菌体分泌淀粉酶，将培养基中的淀粉水解为还原糖，残糖浓度由0.734 g/L上升到1.203 g/L，之后残糖浓度逐渐下降，进入对数生长期，残糖被大量消耗;14 h时残糖浓度下降到0.377 g/L;在对数生长后期至稳定期(16～18 h)，菌体数量达到最高不再增加，残糖量缓慢上升18 h为0.827 g/L;18h开始缓慢下降，20～22 h残糖保持0.5 g/L左右。

2.6 补料发酵对L1-9菌株生物量的影响

针对L1-9菌株分批发酵中出现的对数生长中期发酵液黏度大、溶氧不足、最高菌体数偏低、稳定期较短等问题，采用补料发酵，从13h(对数生长中期)开始，多次流加葡萄糖溶液，结果见图2。

图2 L1-9菌株补料发酵生长曲线

由图2可见，在补料发酵过程中，菌体生长曲线呈现出的双“S”形，表现出了明显的“二次生长”特征。这可能是由于补料增加了养分，降低了发酵液黏度，增加了溶氧以及菌体自身的调整，进入稳定期后开始二次生长，发酵周期延长到30h，生物量显著提高，菌体密度达到了到4.63×1010CFU/mL，比分批发酵提高了78.07%。

2.7 L1-9菌株补料发酵过程中的还原糖变化

L1-9菌株补料发酵过程中还原糖的变化结果，见图3。

由图3可见，补料前即13h前，发酵液的残糖变化与分批发酵结果基本一致，菌体先将培养基中的多糖类物质水解为还原糖，在该阶段发酵液营养丰富，残糖含量保持在较高水平，菌体代谢旺盛。

在补料后即13 h后，由于流加葡萄糖，发酵液残糖含量开始转跌为升。通过分批发酵与补料发酵的比较发现:分批发酵在13 h的发酵液残糖浓度低于0.4 g/L，发酵液营养物质消耗，发酵进入了稳定期，残糖浓度为菌体的生长限制因子;而补料发酵在21 h的发酵液还原糖浓度高于0.4 g/L，菌体此后快速增长，在该时段残糖浓度对菌体生长最重要。到24 h，菌体生长放缓，残糖含量为0.446 g/L，说明此时菌体的生长限制因子不再是还原糖含量。

2.8 L1-9菌株发酵过程中溶氧的变化

分批发酵和补料发酵过程中溶氧和生物量变化见图4。

由图4可见，细菌L1-9在迟滞期耗氧较少，发酵罐中溶解氧较高，进入对数生长期，菌体的快速生长消耗氧气引起了溶氧的急剧下降，此时发酵液黏度加大，尽管增加通气量和加大搅拌速度，保证最大供氧条件下，分批发酵和补料发酵在对数中期的溶氧都几乎下降至零，进入稳定期后，分批发酵的溶解氧一直处于较低水平;而补料发酵随着补料的进行，降低了发酵液的黏度，促进了氧气的传递，溶解氧升高，菌体进入二次生长。

2.9 L1-9菌株补料发酵发酵液的抑菌活性

L1-9菌株补料发酵过程中抑菌活性的测定结果见表4。

图3 L1-9不同发酵方式的残糖变化曲线

图4 L1-9菌株50L发酵罐不同发酵方式的溶氧变化

表4 L1-9菌株补料发酵过程中不同时间的抑菌活性

由表4可见，在对数生长前期(4～20 h)，L1-9菌株随着发酵的进行生物量不断增加，抑菌活性逐渐增强，抑菌活性与菌体的生长同步进行，20 h抑菌活性达到高峰，抑菌带宽度为17.75 mm，到22 h仍维持较高的抑菌活性，24 h后抑菌活性逐渐降低。其结果与分批发酵结果一致，表明L1-9菌株抑菌物质为生长关联型产物。伴随着补料的进行，生物量不断增加，但抑菌活性并未增加，这可能是发酵过程中抑菌物质作为营养成分被消耗，或是由于随着发酵的进行抑菌物质被降解失去抑菌活性所致。

3 结论与讨论

研究认为，海洋细菌L1-9菌株在50 L发酵罐中发酵生物量与抑菌活性受通气量、搅拌速度和接种量影响较大，发酵过程中适时补充葡萄糖溶液可显著提高生物量和抑菌作用。通过比较不同发酵条件下的生物量，认为L1-9菌株在50 L发酵罐中分批发酵工艺为:接种量8%(菌龄24 h、浓度为109个细胞/mL)、初始搅拌速度250 r/min、通气量为3 L/min，发酵时间为11～12 h，生物量达2.40×1010CFU/mL;补料分批发酵工艺为:在分批发酵的条件下，发酵13 h开始流加60 g/L葡萄糖溶液，使还原糖保持在0.4 g/L左右，发酵周期30 h，生物量达到4.63×1010CFU/mL，比分批发酵提高了78.07%;抑菌时效测定结果表明发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用伴随着生物量的增加不断加强，20 h抑菌活性达到高峰，

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Study on the Technology of Paenibacillus polymyxa Strain L1-9 in 50 L Fermenter

Ma Gui-zhen1，2，Wang Shu-fang1，Bao Zeng-hai1，2，Wu Shao-jie1，Xia Zhen-qing1，Fu Hong-run1
1(School of Ocean，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China)2(Jiangsu Institute of Marine Resources，Lianyungang 222005，China)

To higher biomass and antimicrobial activities of marine bacteria Paenibacillus polymyxa L1-9 in a 50 L fermenter，the technological processes were optimized with batch and fed-batch fermentation.The result showed that the best process for batch fermentation was following.Inoculum size was 8%with culturing after 24 h and cell concentration was 109cell/mL.Initial rotating speed and ventilator capacity were 250 r/min and 3 L/min respectively.The max biomass，2.40 ×1010CFU/mL，was achieved after 11 ～12 h fermentation.For fed-batch process，the max biomass，4.63 ×1010CFU/mL，was obtained after 30 h.This result was based on keeping 0.4g/L reducing sugar in medium by adding 6g/L glucose after 13h growing.Comparing to batch fermentation，fed-batch fermentation yielded increasing 78.07%products.The antimicrobial activity of L1-9 to Staphlococcus aureaus was tested here.There was an ascending trend when the biomass increased.The activity reached its top at 20h when the inhibition zone was 17.75 mm.The conclusion is that there is a positive correlation between antimicrobial activity and biomass of L1-9 and it is a growth associated strain.

Paenibacillus polymyxa，biomass，antimicrobial activities，ferment抑菌带宽度为17.75 mm，抑菌活性与生物量呈正相关，为生长关联型。

有文献报道，多粘芽胞杆菌的抑菌物质为次生代谢产物，而L1-9菌株产生的抑菌作用在对数生长后期稳定前期最强，表明为初生代谢产物，这与作者以往的研究结果一致。

L1-9菌株发酵过程中需要较高的通气量和搅拌速度，随着发酵的进行发酵液黏度加大，导致溶氧下降，阻碍了生物量的增加和抑菌物质的产生，加大搅拌速度导致了泡沫增加，反而会导致溶氧浓度的降低，这与Johnston等的研究结果一致［11］，为了减少泡沫的产生需要添加消泡剂，但消泡剂对菌体生长有一定的抑制作用。本研究通过适时流加6%葡萄糖溶液，不仅增加营养物质，满足大量菌体对营养物质的需求，同时可降低发酵液黏度、促进氧气的传递、增加溶氧，适当降低搅拌速度减少泡沫的形成，对于提高生物量，保证发酵的顺利进行，显得尤为重要［12－13］。本研究结果为该菌株的大规模发酵和活菌制剂的加工应用奠定了基础。