改良新生大鼠雪旺细胞的体外培养和纯化

陶晓宇, 滕晓华, 刘 波, 段 答, 卢 明

(湖南师范大学第二附属医院(解放军第163医院)神经外科, 中国 长沙 410003)

雪旺细胞( Schwann cells, SCs)是周围神经系统由胚胎时期的神经嵴前体细胞演化形成的胶质细胞，可吞噬变性坏死碎片[1]、分泌神经营养营养因子和神经生长因子[2]以及引导轴突再生[3]．多项研究[ 4-7]表明雪旺细胞移植能促进脊髓损伤、周围神经损伤和中枢神经系统脱髓鞘性疾病等的功能恢复．近年来已成为周围神经修复领域研究的热点．本实验研究了从新生大鼠中获得高纯度SCs并于体外不断传代和增殖的方法．

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

新生SD大鼠(出生第5 d)10只(中南大学湘雅医学院动物部)，DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清FBS(Hyclone)，胰蛋白酶和胶原蛋白酶(Gibco)，L-多聚赖氨酸(Sigma )，阿糖胞苷(Ara-C)(Sigma )，鼠抗S-100(Sigma)，小鼠二步法检测试剂盒(中彬金桥生物工程有限公司)，D-Hank’s液和0.01 mol/L PBS均为本实验室配制，离心管和50 mL玻璃培养瓶，解剖显微镜(北京泰克仪器有限公司)，倒置相差显微镜(OLYMPUS)．

1.2 雪旺细胞的分离和培养

将新生SD大鼠放入盛有络合碘的烧杯中浸泡(完全淹没)消毒15 min，用无菌组织剪依次剪开皮肤、皮下组织，充分暴露坐骨神经，换另外一把组织剪剪取双侧坐骨神经置于盛有D-Hank’s的培养皿中，解剖显微镜下仔细剥离神经鞘膜，PBS洗涤2遍，眼科剪剪碎成0.5 mm3大小， 0.25%(体积分数，全文同)胰蛋白酶和0.03%胶原酶Ⅰ37 ℃水浴混合消化30 min，摇匀后沉淀5 min，吸取上清单细胞悬液移入盛有含10% FBS的 DMEM培养液终止消化，向剩余沉淀内继加上述胰酶和胶原酶继续于37 ℃水浴中混合消化30 min后加入含10% FBS的 DMEM 培养液终止消化，巴氏吸管吹打后用80 μm的细胞筛过滤，离心 (1 500 r/min,5 min),弃上清液，用含 10% FBS的 DMEM培养液重新悬浮，吹散制成单细胞悬液，调整细胞密度至 1×105个/mL，接种到50 mL玻璃培养瓶内,置于37 ℃、5%CO2温箱中培养．

1.3 雪旺细胞的纯化

差速贴壁法+Ara-c抑制法：将上述单细胞悬液接种到50 mL玻璃培养瓶内侧放入培养箱，15 min后转另外一侧放置，30 min后平放，45 min后将未贴壁细胞悬液调整浓度为1×105个/mL，重新接种到多聚赖氨酸包被的50 mL玻璃培养瓶内，24 h后加入Ara-C(终浓度为2 mg/L)，48 h后全量换液，并用PBS洗涤一遍，以除去Ara-C的作用，加入不含血清的DMEM培养液，置于37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养，以后每2～3 d半量换液一次．待细胞长满培养瓶底部 80%面积时,进行传代，加入适量0.125%胰蛋白酶，在倒置相差显微镜下控制消化时间，待雪旺细胞突起收缩后，立即加入含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用吸管轻轻吹打瓶底，再行差速贴壁 15 min×1次，30 min×1次．

1.4 雪旺细胞的鉴定

将纯化后的雪旺细胞调整细胞浓度为1×105个/mL，接种到盖玻片(事先用多聚赖氨酸包被)的六孔培养板内，继续培养2 d后，细胞长满玻片的80%，取出盖玻片，行S-100免疫组化染色鉴定，具体步骤：(1)10.6 g/L PBS洗涤2遍，3 min/遍．4%(体积分数)多聚甲醛固定液于4 ℃冰箱中固定20 min；(2)滴加3%(体积分数)双氧水去内源性酶活性15 min；(3)兔血清37 ℃孵育30 min；(4)滴加鼠单克隆抗体S-100，4 ℃湿盒中过夜；(5)滴加小鼠二步法检测试剂盒工作液，室温下30 min；(6)滴加DAB液显色3～5 min．以上各步骤之后均以10.6 g/L PBS洗涤2遍，3 min/遍．

2 结果

消化后初接种的细胞呈圆形，原代接种24 h后85%以上的细胞呈椭圆或短梭形，胞体饱满，透光性好，有短小突起，其中仍可见少量胞体较大、轮廓不清、透光性较差的成纤维样细胞，Ara-C作用24 h后，极少见到成纤维样细胞，易于与SCs区分．培养第3 d，SCs开始缓慢增殖，SCs 胞体变得更细长、 狭窄, 突起更长、排列更紧密．培养第8、9天，SCs迅速增殖，细胞密集、融合呈漩涡状．S-100免疫细胞组化染色阳性反应细胞达98%，胞质和突起呈棕褐色，胞核淡染．相差显微镜下不同时间点SCs形态照片和S-100免疫细胞化学染色后的SCs照片见图1～4．

图1 相差显微镜下原代培养24 h雪旺细胞形态(×200) 图2 相差显微镜下原代培养7 d雪旺细胞形态(×400)

图3 相差显微镜下原代培养9 d雪旺细胞形态(×400) 图4 第2代S-100免疫组化阳性细胞(×400)

3 讨论

新生大鼠坐骨神经含结缔组织较少，操作方便，接种后容易贴壁生长，成纤维细胞相对较少，SCs增殖分裂能力比成年大鼠的强[8]，但刚出生1～2 d的新生大鼠坐骨神经十分细小，且与周围组织粘连，不易于分离，故选用出生后第5天的．消化时间过长会损害分离出的单个细胞，消化时间过短，分离出的单细胞太少，本试验采用分步消化的方法，避免了消化酶对细胞的过多损害并获取了大量高活性的单细胞．污染细胞主要为成纤维细胞，在光滑玻璃瓶内，成纤维细胞一般在接种后30 min左右开始贴壁，SCs则一般需1 h以上，本实验在传统的差速贴壁方法上做了改进，利用梯度时间点行差速贴壁，在最大程度降低成纤维细胞数量的同时也减少了SCs的丢失，阿糖胞苷是有丝分裂抑制剂，在接种24 h后加入可在成纤维细胞生长高峰期显著抑制其分裂增殖[9]，新生鼠细胞增殖能力和速度强，对阿糖胞苷敏感，因此时间从既往的作用48 h缩短到24 h，而雪旺细胞在培养初的几天内增殖缓慢，到第8、9天达到增殖的高峰期，阿糖胞苷对其影响小，从而改良后的实验方法既起到了抑制成纤维细胞的作用，同时对雪旺细胞的扩增无明显影响．该实验通过梯度时间点多次差速贴壁联合24 h阿糖胞苷抑制法获得了高纯度和高活性的雪旺细胞，鼠抗S-100免疫组化证实SCs纯度达到98%．说明通过精细取材，分步消化，阶段差速贴壁法和适时阿糖胞苷抑制法纯化后SCs的纯度得到提高．

SCs作为周围神经系统的髓鞘形成细胞，能分泌生长因子和为轴突生长提供良好的微环境，在轴突延伸过程中兼起接触引导和神经营养作用[2-3]，在周围神经再生中起重要的作用，对于周围神经缺损修复有重要意义．SCs体外培养和纯化是进一步研究其分泌蛋白、神经修复功能的前提．本实验所建立的培养和纯化方法在其他研究的基础上有所改进，不仅简单易行而且从最大程度上去除了可能污染的细胞，使细胞得到了纯化，为利用SCs做进一步的研究提供了一定的理论基础．

参考文献：

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