姜黄素类似物的合成及体外抗氧化活性研究

陈莉敏，康建军，刘 洋，林友文

福建医科大学药学院，福州350004

姜黄素类似物的合成及体外抗氧化活性研究

陈莉敏，康建军，刘 洋，林友文*

福建医科大学药学院，福州350004

利用不同的芳香醛和乙酰丙酮缩合反应，合成了4种姜黄素类似物(A1～A4)，化合物的结构经IR、1H NMR及MS等测试技术表征确证。采用邻苯三酚法研究化合物的体外抗氧化活性，台盼蓝细胞计数法研究体外抗肿瘤活性。结果表明，化合物A1、A2、A3的抗氧化活性和对K562细胞增殖的抑制活性均高于姜黄素，其活性与酚羟基密切相关。

姜黄素;类似物;合成;抗氧化活性;抗肿瘤活性

姜黄素(Curcumin，1，7-二(4-羟基-5-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮，见Scheme 1)是中药姜黄的主要成分，是一种天然的酚类食品添加剂。1985年印度Kuttan首次发现姜黄素具有抗肿瘤活性［1］，近年的研究发现其还具有广泛的生物活性如抗氧化、降血脂、抗菌以及抑制HIV-1整合酶活性［2］。姜黄素抗肿瘤作用包括对多种肿瘤细胞的体外生长抑制和诱导凋亡能力，体外抑制血管内皮细胞增殖和体内抑制毛细血管生成和增长［3］，而且具有分子量低、毒性小等特点。但由于其在水中溶解度小，稳定性差，生物利用度低等限制了应用［4］。目前，以新型天然植物活性成分为先导物进行结构优化和改造，是新药研发的重要途径之一，其中姜黄素类似物的研究引起广泛的重视。

从姜黄素母核结构分析，两个取代芳环通过1，6-庚二烯-3，5-二酮的连接桥链B部分把A、C两个取代芳环相连接(见Scheme 1)，并认为A、C两个不同基团取代的芳环可能为发挥抗肿瘤作用的关键结构单元［5］。本文对芳环取代基进行改造，通过1，7-位芳香环上取代基位置和种类的变化，在催化剂作用下，利用芳香醛和乙酰丙酮的缩合反应合成了一系列姜黄素类似物(见Scheme 2)，研究了它们的体外抗氧化和抗肿瘤活性，并探讨A、C两个芳环上取代基对活性的影响。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

AVATR 330 FT-IR红外光谱仪(美国Thermo Nicolet公司)，KBr压片;1100型高效液相色谱-离子阱质谱联用仪(LC/MSD Trap)(美国Agilent公司); UNITY 500型超导核磁共振波谱仪(美国，Varian公司)，TMS为内标，CDCl3为溶剂;岛津2450型紫外可见分光光度计;WRS-1B数字熔点仪(上海精密科学仪器有限公司)，温度计未校正;台盼蓝(SIGMA公司);姜黄素、芳香醛及其他试剂均为分析纯。

1.2 姜黄素类似物的合成

以四种不同的芳醛为原料，与乙酰丙酮在正丁胺作用下合成四种姜黄素类似物，合成方法如下:在装有滴液漏斗的三颈瓶中先后加入0.1 mol芳香醛，0.05 mol乙酰丙酮，0.05 mol B2O3粉末，5 mL硼酸三正丁酯，80℃恒温水浴，充分搅拌溶解，边搅拌边滴加1.5 mL正丁胺，于15 min内滴完，继续搅拌反应2 h，将体系倾入150 mL热的HAC中，搅拌2 h后，冰箱静置冷藏，经不同方法分离纯化得到目标物A1～A4。

A1［1，7-二-(2-羟基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分离纯化:冰箱静置分层，收集下层橙红色油状物，浓缩至胶状透明，用乙醇重结晶，得到橙红色晶体，收率85.4%。

A2［1，7-二-(4-羟基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分离纯化:冰箱静置，抽滤水洗析出固体，用乙腈∶水=3∶1重结晶，得褐色结晶性粉末，收率78%。

A3［1，7-二-(3，4-二羟基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分离纯化同A2，得浅褐色结晶性粉末，收率84%。

A4［1，7-二-(2-吡啶基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分离纯化:反应液浓缩，得黑色粘稠物，加少量氯仿溶解后，经硅胶柱层析分离，以氯仿∶甲醇按4∶1，7∶3和6∶4梯度洗脱，得褐色固体，收率75.2%。

1.3 姜黄素及姜黄素类似物对O-·2的清除率测定

在碱性条件下，邻苯三酚法非常容易发生自氧化，同时伴随着O-·2的生成。本文参照文献［6］的实验方法，利用姜黄素类似物对邻苯三酚法自氧化的抑制来间接评价它们对O-·2的清除。1.3.1 移取5.00 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，加入4.70 mL去离子水，混匀后在25℃水浴中温育20 min。取出后立即加入在25℃预热过的0.30 mL 3 mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀后倒入比色杯，320 nm下每隔30 s测定吸光度值α (以5.00 mL Tris-HCl缓冲液和5.00 mL去离子水的混合液为对照)，以吸光度(α)对时间(t)作图，其斜率为邻苯三酚自氧化速率ν0。

1.3.2 平行取5.00 mL pH8.2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液5份，分别加入4.2，3.7，3.2，2.7，2.2 mL的去离子水，再分别加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 0.5 mmol/L甲醇溶液的样品，最后均加入0.3 mL邻苯三酚使各份总体积保持在10mL，按上述ν0测定方法测得姜黄素及黄素类似物在不同浓度下的邻苯三酚自氧化速率νC，按照公式η=(1－νC/ν0) ×100%计算求得到各样品浓度下的清除率η。

1.4 姜黄素类化合物的抗肿瘤活性研究

体外实验测定了姜黄素类似物对慢性粒细胞性白血病K562细胞增殖的抑制作用，筛选模型为台盼蓝细胞计数法。在96孔培养板上，接种K562细胞，接种量约5×104个/孔，每孔200 μL，本次实验组设6组，分别加入不同浓度的药物，使之终浓度分别为:2.5、5、10、20、40、80 ug/mL。对照组不加药，每组设三个平行孔，37℃培养至48 h，取0.4%台盼蓝液与细胞悬液各50 μL混匀后，再取适量混合液充于细胞计数板上，计数4个大格的未染色的活细胞数。

细胞生长抑制率=(对照组细胞数－实验组细胞数)/对照组细胞数×100%

以同一药物的不同浓度的对数值对肿瘤细胞生长抑制率作图，可得到剂量反应曲线，根据线性回归方程求出该药物的半数抑制浓度IC50，即细胞存活率减少50%时的药物浓度。

2 结果与讨论

2.1 关于姜黄素类似物的合成反应

经典的查尔酮衍生物的合成方法是以取代苯乙酮与取代苯甲醛在碱性醇溶液中缩合得到，文献报道［7］苯甲醛或苯乙酮上的羟基对缩合反应收率的影响很大，当环上有两个或两个羟基以上时，反应几乎不能进行。所以，羟基查尔酮不能用经典的方法合成。也有用羟基保护的方法合成羟基查尔酮，但使用此法结果先保护后缩合时，反应还需要脱保护，操作繁琐，副产物多，难以分离。

本研究是利用不同的芳香醛和乙酰丙酮在硼酸和硼酸三正丁酯作用下反应合成姜黄素类似物，由于乙酰丙酮的3-亚甲基酸性比甲基强，在有机碱的作用下会优先失去质子氢发生反应，产生较多的副产物。故在制备中先将乙酰丙酮3-亚甲基与硼酸形成配合物进行保护，避免3-亚甲基优先反应，然后再与芳香醛进行缩合，采用此法副产物少，分离简便，收率较高。

2.2 姜黄素类似物的理化性质及其结构的波谱表征

所合成的化合物经过了IR、1H NMR和MS等光谱的表征确证，波谱数据及产率、理化性质见表1。

表1 目标化合物的熔点及IR、1H NMR和MS数据Table 1 Melting point，IR，1H NMR and MS data of the target compounds

IR数据显示，A1～A3在3300 cm–1左右均出现羟基吸收峰，而A3由于3位和4位羟基可形成分子内氢键，所以在3328.08 cm–1处出现一宽而强的峰;结构中的β-二酮由于与之相连的烷基体积较大，且含有芳环，故ν(C=O)吸收频率降低，在1600 cm–1～1654 cm–1间出峰。1H NMR数据显示，芳环上羟基取代数量及位置的不同，影响芳核上氢的化学位移，A3由于芳环上有两个羟基取代，所以化学位移值在A1～A3中处于最低;β-二酮结构中的亚甲基上的H因为两个羰基的吸电子作用，化学位移值明显增大。

2.3 姜黄素类似物的体外抗氧化活性

目标化合物对O-·2的清除率的结果见表2。

表2 目标化合物和姜黄素对O-·2的清除率Table 2 Clearance rate of target compounds and curcumin on superoxide radicals

由表2数据可以看出，A1、A2、A3、A4均具有较好的清除O-·2的作用，并且清除作用随样品浓度增大呈现递增趋势，其中A1、A2、A3的体外抗氧化活性高于姜黄素。

2.4 姜黄素类似物对K562细胞增殖的体外抑制活性

目标化合物对人的慢性粒细胞性白血病K562细胞的体外活性初步测试结果列于表3。

表3 目标化合物和姜黄素对K562细胞的体外IC50Table 3 IC50of target compounds and curcumin against K562 cells in vitro

姜黄素的抑制肿瘤活性在一定程度上与其抗氧化活性有关［8］，一般来说，在姜黄素类化合物中，抗氧化的活性部位有两个，一为酚羟基，另一个是β-二酮的亚甲基。A4结构中用吡啶环取代苯环，芳环无羟基取代，发现其活性明显低于姜黄素，与Junko［9］的研究结果一致。而A1～A3姜黄素类化合物均具有酚羟基和β-二酮结构单元，结果表明都具有抗氧化和抗肿瘤活性;酚羟基取代在芳环邻位使活性高于在其他位置的取代，上述结果进一步验证了姜黄素的抑制肿瘤活性在一定程度上与其抗氧化活性有关的观点，也表明在姜黄素结构中酚羟基的取代位置是发挥作用的主要因素。

1 Kuttan R.Potential anticancer activity of turmeric(Curcuma longa).Cancer Lett，1985，29:197-202.

2 Vajragupta O，Boonchoong P，Morris GM，et al.Active site binding modes of curcumin in HIV-1 protease and integrase.Bioorg Med Chem Lett，2005，15:3363-3368.

3 Aggarwal BB，Kumar A，Bharti AC.Anticancer potential of curcumin:preclinical and clinical studies.Anticancer Res，2003，23:363-398.

4 Wang YJ，Pan MH，Cheng AL，et al.Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products.J Pharm Biomed Anal，1997，15:1867-1876.

5 Robinson TP，Ehlers T，Hubbard RB，et al.Design，synthesis，and biological evaluation of angiogenesis inhibitors:aromatic enone and dienone analogues of curcumin.Bioorg Med Chem Lett，2003，13:115-117.

6 Wu RL(武荣兰)，Feng S(封顺)，Wang JD(王吉德).Study on the inhibition effect of baicalin and baicalin metallic coordination.Sci Technol Rev(科技导报)，2006，24:36-38.

7 Chen WM(陈万木)，Guo HX(郭宏雄).The effect of substituted groups in benzen ring on the condensation reaction of acetophenones with benzaldehydes.Synth Chem(合成化学)，1999，7:422-426.

8 Barclay LR，Vinqvist MR，Mukai K，et al.On the antioxidant mechanism of curcumin:classical methods are needed to determine antioxidant mechanism and activity.Org Lett，2000，2:2841-2843.

9 Junko I，Hironor O，Yoko T，et al.Bioorg Med Chem，2002，10:3481.

Synthesis and in vitro Antioxidant Activity of Curcumin Analogs

CHEN Li-min，KANG Jian-jun，LIU Yang，LIN You-wen*
Faculty of Pharmacy，fujian medical university，fuzhou，350004

Four curcumin analogs(A1-A4)were synthesized with various aromatic aldehyde and 2，4-pentanedione as raw materials via condensation reactions.The structures of all synthesized compounds were characterized by IR，1H NMR and mass spectra.Antioxidant activity in vitro of curcumin analogs were studied by the pyrogallol autoxidation method.Trypan blue staining assay was used to evaluate the in vitro antitumor activity of these derivatives.The results showed that antioxidant activity and the inhibitory activity of K562 cell proliferation of compounds A1，A3and A4was both higher than that of curcumin.The analysis of structure activity shows that the antioxidant and antitumor activities of curcumin analogs are related to-OH groups of Aromatic ring.

curcumin;analogs;synthesis;antioxidant activity;antitumor activity

1001-6880(2011)04-0722-04

2010-02-02 接受日期:2010-05-11

福建省自然科学基金计划资助项目(2009J01158)、福建医科大学教授学术发展基金计划(JS09004)、福建省教育厅科技项目(JA07083)

*通讯作者 E-mail:linhumor@sina.com

R962;R284.3

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