反相高效液相色谱法测定升麻药材中升麻苷H-1的含量

姚梅芬，王岳峰，李 展，潘瑞乐，赵晓宏，斯建勇*

1中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193，2西南交通大学药学院，成都610031

反相高效液相色谱法测定升麻药材中升麻苷H-1的含量

姚梅芬1，2，王岳峰2，李 展1，潘瑞乐1，赵晓宏1，斯建勇1*

1中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193，2西南交通大学药学院，成都610031

建立升麻药材中升麻苷H-1含量测定的反相高效液相色谱分析方法。使用H＆E XP ODS-A色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.4)，流速为1 mL/min，柱温为26℃，检测波长203 nm。测得升麻苷H-1线性范围为0.95～28.5 μg/mL(r=0.9999)，平均回收率(n=6)为99.35%(RSD= 2.79%)，不同来源批次升麻药材含量测定结果表明，升麻药材中升麻苷H-1含量为0.53%～1.09%，综合分析批样品含量测定结果，建议升麻药材中含升麻苷H-1应不低于0.4%。本方法简便、准确、重复性好、专属性强，可作为升麻药材质量控制方法。

升麻;升麻苷H-1;高效液相色谱法;含量测定

升麻为常用中药，《中华人民共和国药典》2005年版一部收载的升麻药材有三种，分别为毛茛科植物大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia kom.、兴安升麻C.dahurica(Turcz.)Maxim.或升麻 C.foetida L.。升麻具有清热解毒、升举阳气、发表透疹的功效，主治风热头痛、齿痛、咽喉痛、子宫脱垂等症［1］。升麻根茎中主要含有三萜及其甙类、苯丙酸类、色酮类及其它类型的化合物［2］。阿魏酸和异阿魏酸等苯丙酸衍生物具有抗炎活性，一般认为是升麻清热解毒的有效成分，并以所含阿魏酸和异阿魏酸为指标控制其质量［3，4］.近年的研究表明升麻中所含的三萜类成分具有解毒、抑制核苷运转、抗病毒和治疗妇女更年期综合症及抗骨质疏松等活性［2，5］，以三萜皂苷27-脱氧升麻亭(27-deoxyactein)为指标测升麻中的含量已有报道［6］，但经比较分析，我们发现升麻苷H-1在升麻中的含量较高，易检出，以升麻苷H-1指标控制其质量，更为合理。本文将以 RPHPLC法对不同品种、不同产地升麻中三萜皂苷升麻H-1(cimicifugoside H-1)的含量进行测定，为升麻药材质量评价提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪(Waters 600 Controller，AF在线脱气机，Waters 2987紫外检测器，CBL 100柱温箱，Empower色谱工作站);超声清洗仪(KQ5200B，昆山超声仪器设备厂);电子天平HANGPING FA1104(上海天平仪器厂)，VV2000旋转蒸发仪(Heidolph)。乙腈(色谱纯，Fisher)，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

升麻苷H-1对照品自制，经UV、IR、MS、1H和13C NMR确认结构为升麻苷H-1(cimicifugoside H-1)［7］，经HPLC峰面积归一化法计算纯度＞98.7%。实验所用升麻样品为采集或市售，经药用植物研究所林余霖教授鉴定。

1.2 色谱条件与系统适应性试验

色谱柱:H＆E XP ODS-A色谱柱(4.6×250 mm，5 μm);流动相:乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.4);流速1.0 mL/min，检测波长:203 nm;柱温26℃，进样量20 μL;采集时间:60 min。在此色谱条件下升麻苷H-1对照品和升麻样品色谱图见图1。在色谱图中升麻苷H-1的保留时间为26 min，与相邻峰的分离度均大于1.5，理论塔板数为17000。

1.3 对照品溶液的制备

精密称取升麻皂苷H-1对照品10 mg，加色谱甲醇制成每1 mL含升麻皂苷H-1 0.1 mg，的溶液，摇匀，即得。

1.4 供试液的制备

取本品粉末(过2号筛)约1 g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，电热套加热回流沸腾1 h，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2 结果与讨论

2.1 线性范围考察

准确称取干燥至恒重的对照升麻苷H-1 1.9 mg至1 mL容量瓶中，用色谱纯甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得对照品贮备溶液，精密吸升麻苷H-1贮备溶液0.5、1、2、5、10、15 μL按正文色谱条件进行HPLC分析，以峰面积对进样量进行回归处理，升麻苷H-1线性回归方程为:y=780100x–1524.5，r =0.9999。本法的线性范围为0.95～28.5 μg/mL，最低定量限(S/N≥10)为0.038 μg/mL，以信噪比(S/N≥3)测得最低检测限为0.0095 μg/mL。

2.2 检测方法及检测波长的确定

我们采用HPLC-UV-ELSD的方法进行测定，发升麻苷H-1有紫外吸收，考虑到紫外检测法的灵敏度较高、仪器普及率高，我们排除蒸发光检测法，确定采用紫外检测法。利用UV-2102 PC型紫外分光光度计进行全波长(190～1000 nm)扫描。结果显升麻苷H-1在203 nm处存在末端吸收，所以我们就确定203 nm为检测波长。

2.3 关于流动相的确定

我们比较了不同比例的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-磷酸等系统，结果表明乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.4)系统分离效果较好。

2.4 提取方法考察

取升麻粉末(过2号筛)约1 g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇/乙醇50 mL，称定重量，分别考察回流、超声两种提取方法，分别考察提取时间(30、60、90、120 min)考察提取溶剂(甲醇、乙醇)样品处理完以后，放冷称定重量，用甲醇/乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，既得。用HPLC-UV检测，测得样品峰面积从而计算得样品中升麻苷H-1的含量。在相同时间60 min、相同溶剂甲醇的条件下考察超声和回流两种方法，结果表明回流提取所得升麻苷H-1的含量比较高;在提取方法一定，提取时间一定的条件下，即回流提取1h考察溶剂乙醇和甲醇，得出甲醇提取的升麻苷H--1含量比较高;在提取方法为回流和提取溶剂为甲醇条件一定时考察提取时间(30、60、90、120 min)，结果表明回流120 min比回流60 min所得的升麻苷H-1的含量稍高，不具显著性;综合以上实验结果表明升麻苷H-1的含量为指标用甲醇加热回流60 min最为合理。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液20.0 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，计算峰面积积分值的RSD，升麻苷H-1的RSD为1.1%，表明精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批药材6份，分别按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液，进样20 μL，记录升麻苷H-1的色谱峰面积值，计算升麻苷H-1的含量平均值(n= 5)为0.66%，RSD为2.67%。

2.7 稳定性试验

精密吸取供试品溶液20 μL，按上述色谱条件分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定，结果表明含量在24 h内基本不变，其RSD(n=6)为0.1%。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量生药样品6份各约0.5 g，对照升麻苷H-1 6份各约2 mg，先将对照品用甲醇溶解，定溶至50 mL，然后注入样品粉末，按供试液制备并测定。进HPLC分析并计算回收率(n=6)，结果升麻苷H-1平均加样回收率为99.35%，RSD为2.79%。结果见表1。

表1 回收率实验Table 1 Recovery test

2.9 样品测定

用微量进样器精密吸取对照品溶液20 μL，供试品溶液20 μL注入HPLC仪，外标法定量。共测定29批样品，其中收集到7批兴安升麻和大三叶升麻样品升麻苷H-1含量很低，升麻升麻苷H-1的含量在0.56%～1.09%，故建议升麻升麻苷H-1的含量规定为:不得少于是0.4%升麻苷H-1的含量测定结果见表2。对照品、样品HPLC色谱图见附图1。

表2 不同品种升麻中升麻苷H-1的含量Table 2 Contents of cimicifugoside H-1 in various producing area and species of Rhizoma Cimicifugae

SM14 甘肃宕昌(升麻) 0.61 SM15 甘肃舟曲(升麻) 0.55 SM16 甘肃武都(升麻) 0.77 SM17 甘肃武都(升麻) 0.71 SM18 甘肃武都(升麻) 0.78 SM19 甘肃武都(升麻) 0.77 SM20 甘肃武都(升麻) 0.63 SM21 甘肃武都(升麻) 0.70 SM22 甘肃武都(升麻) 0.66 SM23 甘肃武都(升麻) 0.61 SM24 甘肃武都(升麻) 0.78 SM25 甘肃武都(升麻) 0.71 SM26 甘肃武都(升麻) 0.76 SM27 甘肃舟曲(升麻) 0.63 SM28 甘肃舟曲(升麻) 0.79 SM29 甘肃舟曲(升麻) 1.09

图1 对照品及供试品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A) and sample(B)

3 结论

升麻质量控制探讨研究发现不同品种升麻所含的异阿魏酸的量有很大差别，升麻中异阿魏酸含量较低，有些甚至检测不出异阿魏酸，而兴安升麻和大三叶升麻中异阿魏酸含量较高。由于升麻总皂苷(希明婷片)已经用于临床治疗妇女期综合征而且升麻中含有异阿魏酸较少，因此我们建议选择升麻中含量较高的升麻皂苷H-1作为控制升麻的质量指标，而兴安升麻以及大三叶升麻含有升麻苷H-1很少，仍然选择异阿魏酸作为控制升麻的质量标准。从含量测定的结果可以看出，不同产地升麻升麻苷H-1含量介于0.53%～1.09%，其中以甘肃舟曲的升麻药材升麻苷H-1含量最高。根据对21批升麻药材升麻苷含量测定的结果，建议升麻药材中升麻苷的含量不应低于0.4%。含量测定实验结果表明，本法操作简便，测定结果准确，具有良好的重复性，可用于升麻药材的质量控制，为保证临床用药的安全，提供了科学、可靠的依据。

1 Pharmacopoeia commission of the People's Republic of China.Part I(中国药典2005版，一部)，2005.50.

2 Lin YP(林玉萍)，Qiu MH(邱明华)，Li ZR(李忠荣).Studies on the chemical constituents and biological activities of Cimicifuga.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2002，14:58.

3 Liu Y(刘颖)，Zhang XX(张小茜).Resrarch on the quality of Rhizoma Cimicifugae.Chin Tradit Herb Drug(中草药)，2005，36:1402-1404.

4 Pan RL(潘瑞乐)，Chen DH(陈迪华)，Shen LG(沈连钢)，et al.Determination of ferulic acid and isoferulic acid in Rhizoma Cimicifugae by HPLC.Chin J Pharm Anal(药物分析杂志)，2000，20:396-398.

5Hu P(胡平)，Zhong TY(钟廷瑜)，Shu GM(舒光明).Development and utilization of Cimicifuga plants in Sichuan and Chongqing area.Resour Dev Market(资源开发与市场)，2005，21:544.

6 Pan RL(潘瑞乐)，Chen DH(陈迪华)，Si JY(斯建勇)，et al.Determination of 27-deoxyactein in various specimens of Rhizom Cimicifugae by RP-HPLC.Central South Pharm(中南药学)，2007，6:206-208.

7 Koeda M，Aoki Y，Sakurai N，et al.Studies on the Chinese crude drug"shoma."IX.Three novel cyclolanostanol xylosides，cimicifugosides H-1，H-2 and H-5，from Cimicifuga Rhizome.Chem Pham Bull，1995，43:771-776.

Determination of Cimicifugoside H-1 in Rhizoma Cimicifugae by RP-HPLC

YAO Mei-fen1，2，WANG Yue-feng2，LI Zhan1，PAN Rui-le1，ZHAO Xiao-hong1，SI Jian-yong1*1Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China;2Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，China

To establish an RP-HPLC method for determination of cimicifugoside H-1 in Rhizoma Cimicifugae.H＆E XP ODS-A(4.6×250 mm，5 μm)column was employed with acetonitrile-water-phosphoric acid(35∶65∶0.4)as mobile phase，the flow rate was 1.0 mL/min.The column temperature was set 26℃ and detection wavelength was set at 203 nm.The linear range of cimicifugoside H-1 was 0.95～28.5 μg，the correlation coefficient was 0.9999 and the average recoveries(n=6)was 99.35%.The method is simple，rapid and reliable，which can be regarded as a reasonable method for determining the content of cimicifugoside H-1 in Rhizoma Cimicifugae.The results can be supported as data bases for developing quality specification of Rhizoma Cimicifugae.

Rhizoma Cimicifugae;cimicifugoside H-1;HPLC;quantitative determination

1001-6880(2011)04-0696-04

2009-08-14 接受日期:2009-11-03

国家药典委员会项目－2010年版药典增修订(YZ-223)

*通讯作者 Tel:86-10-62899752;E-mial:jysi@implad.ac.cn

R284.1;R917

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