正交试验优选春砂仁挥发油羟丙基-β-环糊精包合工艺Δ

张生潭，张帆，汪铁山，林敬明#（.南方医科大学珠江医院药剂科，广州市508；.南方医科大学珠江医院皮肤科，广州市 508）

正交试验优选春砂仁挥发油羟丙基-β-环糊精包合工艺Δ

张生潭1＊，张帆2，汪铁山1，林敬明1#（1.南方医科大学珠江医院药剂科，广州市510282；2.南方医科大学珠江医院皮肤科，广州市 510282）

目的：研究羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）包合春砂仁挥发油的最佳工艺，并进行包合物鉴定。方法：以挥发油利用率、包合物含油率与最高含油率比值和包合物收率的综合得分为评价指标，对搅拌法、超声法和研磨法进行优选；以挥发油与HP-β-CD的投料比、HP-β-CD的浓度、包合时间、包合温度为考察因素，上述综合得分为评价指标，采用正交试验优选最佳包合工艺，并通过显微鉴别、差示扫描量热分析、紫外分光光度、气相色谱质谱联用等方法对包合前、后的包合物进行鉴别。结果：最佳包合方法为超声法，最佳包合工艺条件为挥发油与HP-β-CD的投料比为1∶10（V∶m），HP-β-CD的浓度为40%，包合时间80min，包合温度55℃。包合前、后成分未见明显变化。结论：春砂仁挥发油的HP-β-CD包合工艺切实可行，可为实际生产研究提供一定的试验依据。

春砂仁；挥发油；羟丙基-β-环糊精；包合物；制备工艺

砂仁是姜科植物阳春砂Amomurn villosum Lour、绿壳砂A.villosum Lour.Var.xanthioides T.L.Wu et Senjen或海南砂A.Iongiligulare T.L.Wu的干燥成熟果实[1]。其中以广东阳春产的春砂仁质量为最佳。主治腹痛痞胀、胃呆食滞、噎膈呕吐、寒泻冷痢，是临床常用中药之一，也是中国著名的四大南药之一。现代药理学研究表明，砂仁挥发油具有促进胃肠机能、促进消化液分泌[2]、抗炎、镇痛[3]、免疫调节[4]、抗动脉血栓及抗凝血作用[5]，但容易受到光、空气、温度等因素影响而使含挥发油制剂的质量及疗效降低。因此，有必要选择合适的辅料制备成合适的剂型，以减少挥发油在生产、贮存过程的挥发及氧化变质。环糊精（CD）作为新型的药物辅料，其独特的环状中空结构具有一定的药物包合能力，各种类型的β-CD可以提高药物的溶解度[6]，并可促进生物膜对药物的吸收，降低药物对生物膜刺激性等[7]。因此，本试验采用羟丙基（HP）-β-CD为包合材料，采用冷冻干燥法制备包合物，并以包合物综合评分为评价指标进行包合工艺优选[8]，对春砂仁挥发油进行包合，以使挥发油与外界环境隔离，从而提高药物的稳定性、药理作用及生物利用度[9]。

1 仪器与试药

HP6890/5973型气相色谱质谱联用（GC-MS）仪（美国Agilent公司）；PE lambda-35型紫外分光光度计（美国Perkin Elmer公司）；DSC 204型差示扫描量热仪（德国Netzsch公司）；LaBconco freezone 6型冷冻干燥机（美国LaBconco公司）；BL-2000S型电子天平（美国Serea公司）；KQ-600DE型数控超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；TC-15型电热恒温器（海宁市新华医疗器械厂）；JB50-D型电磁搅拌器（上海标本模型厂）。

CAVASOL®W7型HP-β-CD（美国Wacker化学公司）；春砂仁饮片（广州市药材公司中药饮片厂，批号：20090601）；石油醚、无水乙醇、乙醚等试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 挥发油的提取

春砂仁去壳，粉碎，过2号标准筛网。称取适量药材粉末，置于蒸馏烧瓶中，加5倍量蒸馏水及玻璃珠数粒，浸泡过夜，按2005年版《中国药典》项下方法[1]提取6h，得到的挥发油用无水硫酸钠脱水，乙醚洗涤挥发油提取器，低温下挥去乙醚，得干燥的挥发油（为淡黄色油状液体），平行提取6次，春砂仁平均含油率为3.57%（mL·g-1）。挥发油置于阴凉干燥处避光保存，备用。

2.2 包合方法的选择

包合物的制备方法常有搅拌法、超声法和研磨法，本试验分别采用3种包合方法对挥发油进行包合，以包合物综合得分为指标优选最佳包合方法。

2.2.1 搅拌法 取HP-β-CD适量，置于100mL三颈烧瓶中，加适量蒸馏水配成40%的HP-β-CD水溶液，于磁力搅拌器中40℃下缓慢加入“2.1”项下制备的挥发油的无水乙醇溶液（挥发油∶乙醇＝1∶2，V/V），搅拌至规定时间后取出，用石油醚洗涤3次（每次5mL），除去未被包合的挥发油，冷冻结冰，置于冷冻干燥机中干燥（冷冻干燥条件：－50℃，0.09MPa，12h），即得干燥包合物，取出，置于干燥器中保存，备用。

2.2.2 超声法 取HP-β-CD适量，置于100mL具塞三角瓶中，加适量蒸馏水配成40%的HP-β-CD水溶液，于超声清洗仪中40℃下缓慢加入“2.1”项下制备的挥发油的无水乙醇溶液（挥发油∶乙醇＝1∶2，V/V），超声包合至规定时间后以下操作同“2.2.1”项下方法。

2.2.3 研磨法 取HP-β-CD适量，置于研钵中，加适量蒸馏水配成40%的HP-β-CD水溶液，于40℃条件下，边研磨边缓慢加入“2.1”项下制备的挥发油的无水乙醇溶液（挥发油∶乙醇＝1∶2，V/V），研磨至规定时间后以下操作同“2.2.1”项下方法。

2.2.4 空白回收率的测定 精密量取春砂仁挥发油1.00mL，置于1000mL圆底烧瓶中，加200mL蒸馏水、沸石几粒，按2005年版《中国药典》项下方法[1]提取，得到的挥发油用无水硫酸钠脱水，乙醚洗涤挥发油提取器，低温下挥去乙醚，称量，平行6次试验，并按下式计算空白回收率：空白回收率（%）＝回收挥发油量（mL）/挥发油加入量（mL）。结果，挥发油的平均空白回收率为94.5%。

2.2.5 包合物综合得分的计算 包合物综合得分＝包合物收率×20+（包合物含油率/最高含油率）×30+挥发油利用率×50；最高含油率（%）＝挥发油投入量（mL）/（HP-β-CD投入量+挥发油投入量）（g）×100%；包合物收率（%）＝包合物收得量（g）/（HP-β-CD投入量+挥发油投入量）（g）×100%；挥发油利用率（%）＝包合物含油量（mL）/（挥发油投入量（mL）×空白回收率）×100%；包合物含油率（%）＝包合物含油量（mL）/（包合物重量（g）×空白回收率）×100%。以包合物综合得分为指标，评价包合方法。结果，超声法制备包合物的综合得分相对较高，故采用超声法制备包合物。3种包合方法的比较见表1。

2.3 包合物制备工艺的选择

2.3.1 试验设计 根据预试验，确定了对包合工艺影响较大的挥发油与HP-β-CD的比例（A）、HP-β-CD的浓度（B）、包合时间（C）和包合温度（D）为考察因素，每个因素选取3个水平，以挥发油利用率、包合物含油率与最高含油率比值、包合物收率及其综合得分为评价指标，采用L9（34）正交表进行试验。因素水平见表2。

表1 3种包合方法的比较Tab 1 Comparison of 3kinds of inclusion methods

表2 因素水平Tab 2 Factors and levels

2.3.2 试验结果 包合物按“2.2.2”项下方法制备，试验因素水平照L9（34）正交表设计安排。包合物制备并干燥后，精密称量。并精密称取干燥包合物适量，置于1000mL圆底烧瓶中，加200mL蒸馏水，按2005年版《中国药典》项下方法[1]提取，得到的挥发油用无水硫酸钠脱水，乙醚洗涤挥发油提取器，低温下挥去乙醚，得干燥的挥发油，按“2.2.5”项下公式计算包合物收率、包合物含油率与最高含油率的比值、挥发油利用率及其综合得分，以此为指标分析正交试验。正交试验结果见表3；方差分析结果见表4。

表3 正交试验结果Tab 3 Results of orthogonal experiment

表4 方差分析结果Tab 4 Results of variance analysis

从表3、表4可知，各因素对试验结果的影响程度为A＞C＞B＞D，因素A、C对包合工艺具有显著性影响，最佳包合工艺为A2B2C3D2，即挥发油∶HP-β-CD＝1∶10（V∶m），HP-β-CD浓度为40%，包合时间为80min，包合温度为55℃。2.3.3 验证试验 取HP-β-CD 3份，按优选出的最佳工艺条件进行包合并测定各项指标。结果，其包合物平均收率为92.8%，挥发油含油率与最高含油率的平均比值为84.5，挥发油平均利用率为79.4%，综合评分为83.61，与正交试验结果相近，表明包合工艺稳定、可行。

3 包合物鉴定

3.1 显微鉴别

分别取HP-β-CD、挥发油包合物，于光学显微镜下观察。结果，HP-β-CD呈近透明晶体状，包合物为不透明团状物质，表观形态发生变化，表明包合物初步形成。显微鉴别见图1。

图1 显微鉴别（×40）A.包合前；B.包合后Fig 1 Microscopic identification（×40）A.before inclusion；B.after inclusion

3.2 差示扫描量热分析（DSC）鉴别

取HP-β-CD、挥发油与HP-β-CD物理混合物、挥发油包合物，置于DSC 204差示扫描量热仪中进行测定，记录升温曲线。结果，由DSC曲线可看出，HP-β-CD挥发油物理混合物与HP-β-CD比较，在119℃附近有一较宽的吸热峰，而包合物在此无吸热峰出现；包合物在274℃附近出现一个较宽的新的吸热峰，与物理混合物的DSC曲线有别，表明挥发油与HP-β-CD形成了新的物相，可判断包合物基本形成。差示扫描量热分析图见图2。

图2 差示扫描量热分析图A.空白HP-β-CD；B.HP-β-CD与挥发油物理混合物；C.挥发油包合物Fig 2 DSCA.blank HP-β-CD；B.physical mixture of HP-β-CD with volatile oil；C.inclusion complex of volatile oil

3.3 紫外分光光度法鉴别

分别制备样品①挥发油甲醇溶液、②包合物甲醇溶液、③包合物末次洗涤液、④HP-β-CD甲醇溶液，于紫外分光光度计中在200～450nm波长范围内扫描。结果，包合物末次洗涤液只有微弱吸收，说明未被包合的挥发油基本洗涤干净，包合物与挥发油的吸收图谱基本相同，表明包合物形成过程为一物理包合过程，未与HP-β-CD发生化学反应，包合物基本形成。紫外吸收光谱见图3。

图3 紫外吸收光谱①.挥发油甲醇溶液；②.包合物甲醇溶液；③.包合物末次洗涤液；④.HP-β-CD甲醇溶液Fig 3 UV absorption spectrum①.methanol solution of essential oil；②.methanol solution of inclusion complex；③.last washing liquid of inclusion complex；④.methanol solution of HP-β-CD

3.4 GC-MS法鉴别

取春砂仁包合前挥发油、包合物中提取的挥发油各适量，置于GC-MS仪中检测。结果，从总离子流图可看出，挥发油包合前、后的成分基本没有发生变化，表明HP-β-CD可对春砂仁挥发油成分进行全面包合，保证了挥发油成分包合前、后的稳定，保持了挥发油的天然活性。总离子流图见图4。

图4 总离子流图A.包合前；B.包合后Fig 4 Total ion currentA.before inclusion；B.after inclusion

4 讨论

本研究采用综合评分系统对包合工艺进行评价，考虑到挥发油的包合率在实际生产中对制剂的质量及疗效的影响较大，故其权重系数定为50，而包合物收率和包合物的含油率与最高含油率比值为实际生产中需重要考虑的因素，故其权重系数分别定为20、30。以此综合得分来评价包合工艺的优劣，可较全面地评价包合物的制备工艺，对实际生产具有一定的指导意义。显微鉴别和DSC曲线显示，春砂仁挥发油包合物与HP-β-CD及其物理混合物的物相相比均不相同，说明包合物形成了一种新的物相，初步证明挥发油与HP-β-CD形成了包合物；挥发油由液体变为包合物固体，紫外吸收图谱显示，挥发油与HP-β-CD形成包合物过程中，未发生化学变化，包合过程属于物理包合过程；总离子流图显示，包合物前、后挥发油成分未发生显著变化，既保持了春砂仁挥发油的天然特性，又达到了提高药物稳定性的目的。同时，本试验采用HP-β-CD作为包合材料，大大增加了挥发油的水溶性，药物由液态变为固态，提高了药物的稳定性并利于制成多种剂型，进而提高患者的顺应性。采用冷冻干燥技术制备的的包合物也可制成注射用无菌粉末，增加药物的给药途径，有利于提高其生物利用度。药物分子进入到CD的骨架当中，可使制剂具有缓释作用[10]，从而减少用药次数，降低药物毒副作用，同时增加患者用药的顺应性。但在包合过程中，应注意超声时间及包合温度的选择与控制，时间过长或温度过高，都可能造成挥发油从包合物中重新释放出来，从而降低包合率和含油率等，影响包合效果。

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：17、附录57.

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Optimization of the Preparation Technology of Amomum villous Oil-hydroxypropyl-β-Cyclodextrin Inclusion Complex by Orthogonal Experiment

ZHANG Sheng-tan,WANG Tie-shan,LIN Jing-ming（Dept.of Pharmacy,Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510282,China）

ZHANG Fan（Dept.of Dermatology,Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510282,China）

OBJECTIVE：Tooptimizethepreparationtechnologyof Amomum villousoil-hydroxypropyl-β-cyclodextrin（HP-β-CD）inclusion complex,and to identify the inclusion complex.METHODS：With the utilization ratio of volatile oil，ratio of oil content to the highest oil content and yield of inclusion complex as index,the stirring method,ultrasonic method and trituration method were optimized.The preparation technology of inclusion complex was optimized by orthogonal experiment taking the comprehensive evaluation score as index with ratio of volatile oil to HP-β-CD,concentration of HP-β-CD,inclusion time and inclusion temperature as factors.Microscopic identification method,DSC method，UV method and GC-MS method were used for the identification of inclusion complex.RESULTS：Ultrasonic method was the best preparation method,and the optimal preparation condition as following：the ratio of volatile oil to HP-β-CD was 1∶10（V∶m）,the concentration of HP-β-CD was 40%,the time and temperature for inclusion was 80min and 55℃.No obvious change was found before and after inclusion.CONCLUSION：The optimized preparation technology of A.villous oil-hydroxypropyl-β-cyclodextrin is feasible and serves as reference for the production and research.

Amomum villous；Volatile oil；Hydroxypropyl-β-cyclodextrin；Inclusion complex；Preparation technology

R284.2；R284.1

A

1001-0408（2011）03-0225-04

Δ广州市科技计划项目（2008Z1-E461）

＊硕士研究生。研究方向：天然药物有效成分研发。电话：020-61643557。E-mail：shengtan1986@163.com

#通讯作者：副教授，硕士研究生导师，博士。研究方向：天然药物有效成分研发。电话：020-61643557。E-mail：linjm1231@21cn.com

2010-09-06

2010-11-04）