响应曲面法优化桑枝多糖提取工艺Δ

徐卫东，王佩香，欧阳臻#，赵明，2，张磊，汤建明（.江苏大学药学院，镇江市2203；2.江苏大学附属医院，镇江市 2200）

响应曲面法优化桑枝多糖提取工艺Δ

徐卫东1＊，王佩香1，欧阳臻1#，赵明1，2，张磊1，汤建明1（1.江苏大学药学院，镇江市212013；2.江苏大学附属医院，镇江市 212001）

目的：利用响应曲面法优化桑枝多糖的提取工艺。方法：以桑枝多糖得率为指标，采用单因素和响应曲面法对提取温度、提取时间、料液比和提取次数进行考察，优选最佳提取工艺。结果：最佳提取工艺条件为提取温度100℃、料液比1∶20、浸提时间2.5h、提取2次，实际测得的多糖得率为6.15%，与模型预测值基本相符。结论：模型可较好地预测桑枝多糖的得率，响应曲面法对桑枝多糖提取条件参数优化具有可行性。

桑枝多糖；提取；响应曲面法

桑枝是桑科植物桑树Morus alba L.的干燥嫩枝，性微苦、平，归肝经，具有祛风湿、利关节、行水气之功效[1]。桑枝所含化学成分种类较多，主要含有多糖、黄酮、生物碱和香豆素等。现代药理研究表明，桑枝多糖具有降血糖[2]、调节免疫[3]、抗氧化[4]等药理活性。

响应曲面法（Response Surface Method，RSM）是由Box等[5]于20世纪50年代提出的一种优化工艺条件的有效方法。它以回归方程作为函数估算的工具，确定各因素及其交互作用对各指标的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系。目前优化多糖提取工艺多采用正交试验法，而采用RSM优化多糖提取工艺的研究较少[6～8]。本文采用RSM，通过考察关键工艺参数对桑枝多糖得率的影响，优化其提取工艺。

1 仪器与试药

SHB-111循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；FD-1-50冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；R-200旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；240分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；TDL-5-A台式离心机（上海金鹏分析仪器有限公司）。

桑枝采于江苏大学桑树园，经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为桑科植物桑树M.alba L.的干燥嫩枝，烘干，粉碎，备用；水为高纯水，乙醇等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 桑枝多糖的提取工艺流程

桑枝→粉碎→热水浸提→离心→上清液→减压浓缩→醇析→离心→真空干燥→桑枝多糖粗品。称量多糖粗品，作为多糖质量。

2.2 桑枝多糖得率的计算

桑枝多糖得率＝多糖质量/药材质量×100%

2.3 单因素试验

根据预试验结果，选取对多糖得率有显著影响的提取温度、提取时间、料液比和提取次数为考察因素，以桑枝多糖得率为评价指标，进行单因素试验。

2.3.1 提取温度对桑枝多糖得率的影响 称取经粉碎后的桑枝10g，置于500mL圆底烧瓶中，加水200mL煎煮2.5h，提取1次，分别考察不同温度（60、70、80、90、100℃）对多糖得率的影响。结果，在60～100℃温度范围内，随着提取温度的升高，多糖得率显著增加；温度升高到一定程度后，多糖得率变化不大，并且高温可能使部分多糖降解，因此选择提取温度为90℃较适宜。

2.3.2 提取时间对桑枝多糖得率的影响 称取经粉碎后的桑枝10g，置于500mL圆底烧瓶中，加水200mL，90℃提取1次，分别考察提取不同时间（1、2、2.5、3、3.5、4h）对多糖得率的影响。结果，随着时间的延长，多糖得率不断增加，且在2.5h之前增加较为显著，之后反而下降；随着提取时间的延长，其他成分也同时被提取出，影响多糖的得率，因此选择提取时间为2.5h较适宜。

2.3.3 料液比对桑枝多糖得率的影响 称取经粉碎后的桑枝10g，置于500mL圆底烧瓶中，90℃提取1次，提取2.5h，分别考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）对多糖得率的影响。结果，在料液比较低时，多糖得率随料液比的增大而显著提高；在料液比1∶20时，多糖得率达到最高值；料液比超过1∶20后多糖得率没有明显增加，而加水量过大可使后续工序能耗增加、效率降低，因此选择料液比1∶20为宜。

2.3.4 提取次数对桑枝多糖得率的影响 称取经粉碎后的桑枝10g，置于500mL圆底烧瓶中，加水200mL，90℃提取，提取2.5h，考察提取次数（1、2、3、4次）对多糖得率的影响。结果，随着提取次数的增加，多糖得率显著增加，但是提取3次后，多糖得率基本保持不变。

2.4 响应面试验

2.4.1 试验设计 根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，分别以X1、X2、X3和X4表示提取温度、提取时间、料液比和提取次数，按方程Xi＝（Xi′－X0）/ΔX对自变量进行编码。式中，Xi为变量的编码值；Xi′为变量的真实值；X0为试验中心点变量的真实值；ΔX为变量的变化步长，多糖得率（Y）为响应值。每一自变量的低、中、高试验水平分别以－1、0、+1进行编码。因素水平及编码见表1；试验设计方案及结果见表2。

表1 因素水平及编码Tab 1 Factors，levels and codes of response surface method

表2 试验设计方案及结果Tab 2 Design and results of experiment

如表2所示，共29个试验点，其中24个为析因点，5个为零点，析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点；零点为区域的中心点。其中零点试验重复5次，用以估算试验误差。

2.4.2 模型的建立及显著性检验 利用Design-Expert软件对表2中的试验数据进行多元回归拟合，得到桑枝多糖对提取温度、提取时间、料液比和提取次数的二次多项回归模型为Y＝5.45640+0.86692X1+0.30450X2+0.46875X3+0.49950X4+0.24600X1X2+0.29475X1X3+0.17050X1X4+0.12250X2X3+0.49800X2X4－ 0.13650X3X4－0.60070X12－0.86282X22－0.40995X32－1.29608X42。对该模型和模型系数分别进行显著性检验，结果分别见表3、表4。

表3 回归模型的方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis of regression model

表4 回归模型系数的方差分析结果Tab 4 Results of variance analysis of regression model coefficient

从表3可知，整体模型的P值＜0.001，表明该二次方程模型比较显著；模型的失拟项的P值为0.6563＞0.05，说明模型选择合适；并且该模型总回归系数R2＝0.9250，说明该模型与实际试验拟合较好，可以用于桑枝多糖热水浸提试验的理论预测。

从表4可知，模型的一次项提取温度是极显著的（P＜0.0001），一次项料液比和提取次数是高度显著的（P＜0.01）；交叉项中提取时间和提取次数是显著的（P＜0.05），而其余的交叉项则不显著；二次项都是显著的（P＜0.05），表明各个影响因素与响应值不是简单的线性关系。

2.4.3 各因素间的交互影响 为了进一步研究相关变量之间的交互作用，笔者利用响应面曲线图和等高线图来进行可视化的分析。6组图分别显示了不同交叉因素对桑枝多糖得率的交互影响趋势，等高线图可以直观地反映出两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不明显，而曲率半径较大的椭圆则表示两因素交互作用显著，并且曲率半径越大，交互作用越显著，即椭圆越扁平，交互作用越显著。在等高线图上，最大的椭圆即最外围的椭圆代表在该圆上取值时，多糖得率最低，而最小的椭圆则表示在其上面取值时，多糖得率最高，它们之间的等高线代表多糖得率逐渐变化，详见图1～图6。

图1 提取温度与提取时间对多糖得率的影响A.响应曲面；B.等高线Fig 1 Effects of extraction temperature and extraction time on the yield of polysaccharidesA.response surface；B.contour

图2 提取温度与料液比对多糖得率的影响A.响应曲面；B.等高线Fig 2Effects of extracton temperature and solid-solvent ratio on the yield of polysaccharidesA.response surface；B.contour

图3 提取温度与提取次数对多糖得率的影响A.响应曲面；B.等高线Fig 3 Effects of extraction temperature and extraction times on the yield of polysaccharidesA.response surface；B.contour

从图1、图2和图4上可看出，在2个因素水平固定的条件下，3个图中的其他两因素交互作用不显著。由6组图可知，当料液比一定和提取时间一定时，得率随温度的升高而增加；在提取温度和料液比一定的条件下，得率随提取次数的增加先增大后减小，这说明存在一个最佳的提取次数；当料液比一定时，得率随时间的延长逐渐增大，当达到2.5h后，得率变化不大，说明它们的交互作用不显著；当提取次数一定时，得率随温度的升高变化不大，说明它们的交互作用不显著。这与表4的因素方差分析结果相一致。

图4 提取时间与料液比对多糖得率的影响A.响应曲面；B.等高线Fig 4 Effects of extraction time and solid-solvent ratio on the yield of polysaccharides A.response surface；B.contour

图5 提取时间与提取次数对多糖得率的影响A.响应曲面；B.等高线Fig 5 Effects of extraction time and extraction times on the yield of polysaccharidesA.response surface；B.contour

图6 料液比与提取次数对多糖得率的影响A.响应曲面；B.等高线Fig 6 Effects of solid-solvent ratio and extraction times on the yield of polysaccharidesA.response surface；B.contour

2.4.4 最佳提取工艺条件的确定 结合回归模型的数学分析可知，桑枝多糖最佳提取工艺参数为提取温度101.09℃、料液比1∶19.93、提取时间2.72h、提取次数2.31次。考虑到实际操作条件，将桑枝多糖最佳提取条件修正为提取温度100℃、料液比1∶20、浸提时间2.5h、提取2次，实际测得的多糖得率为6.15%，与理论预测值6.20%相比相差不大，表明回归模型可较好地预测桑枝多糖得率。

3 结论

本试验结果说明回归模型可较好地预测桑枝多糖得率，从而也说明了RSM对桑枝多糖提取条件参数优化的可行性。

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[3] 邬 灏，卢笑丛，王有为.桑枝多糖分离纯化及其免疫作用的初步研究[J].武汉植物学研究，2005，23（1）：81.

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Optimization of the Extraction Technology of Morus alba Polysaccharide by Response Surface Method

XU Wei-dong，WANG Pei-xiang，OUYANG Zhen，ZHAO Ming，ZHANG Lei，TANG Jian-ming（School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）
ZHAO Ming（The Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212001，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Morus alba polysaccharides by response surface method（RSM）.METHODS：Extraction temperature，extraction time，ratio of material to liquid and extraction times were investigated by single factor test and RSM using the yield of M.alba polysaccharides as index to optimize the extraction technology.RESULTS：The optimal condition obtained from RSM was as follow：extraction temperature 100℃，the ratio of material to water 1∶20，extraction time 2.5h，and extracting for 2times.The yield of polysaccharides was 6.15%，which was in line with predicted value basically.CONCLUSION：The model could well predict the yield of M.alba polysaccharides，and RSM is feasible to optimize the extraction technology of M.alba polysaccharides.

Morus alba polysaccharides；Extraction；Response surface method

R284.2；R282.6

A

1001-0408（2011）43-4064-04

2011-04-16

2011-06-15）