HPLC法测定健肝颗粒中绵茵陈成分绿原酸的含量

周淑群 李明艳 周定球

HPLC法测定健肝颗粒中绵茵陈成分绿原酸的含量

周淑群 李明艳 周定球

目的 建立健肝颗粒中绿原酸的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱条件：Diamonsil-C18柱 (250 mm ×4.6 mm,5um);流动相为乙腈 -0.4磷酸溶液 (20：80);流速 0.8 ml/min;检测波长 336nm;柱温 30℃。结果 绿原酸在 9.03～180.6ug/ml范围内,其峰面积值与进样量有良好的线性关系,r=0.9995,平均加样回收率为 99.7%,RSD为 0.71%。结论 该测定方法快速简便,重现性好,可用于健肝颗粒的质量控制。

健肝颗粒;绿原酸;HPLC

健肝颗粒是由甘草、黄花母、虾钳草、黄鳝藤、田基黄、绵茵陈,六味中药制成的制剂,用于治疗急、慢性肝炎。为了有效控制该制剂的质量,本文参照有关文献[1,2],建立高效液相色谱法测定其中绿原酸含量的方法,结果显示该方法简便,精密度好,重复性好,可用于本制剂的质量控制。现介绍如下。

1 仪器和试药

日本岛津 LC-10AT高效液相色谱仪,SPD-10A检测器,CLASS-VP 6.12 SPI色谱数据系统,UV-24010PC紫外分光光度计(日本岛津),北京赛多利斯 BP211D电子分析天平,0412-1离心机,B2500S-MT超声波清洗机。绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号：110753-200413)乙腈、甲醇均为色谱纯,水为注射用水。健肝颗粒剂由本院生产 (批号 ：110104,110107,110112)。

2 处方与制备

取甘草 25 g,黄花母 100 g,虾钳草 100 g,黄鳝藤 100 g,田基黄 100 g,绵茵陈 100 g,尼泊金 0.5 g,总制成 100 g。将上述药材加水浸泡 24 h,煎煮两次,每次 1 h,除药渣后浓缩成流浸膏 (相对密度 1.2),加蔗糖粉 (过 40目筛),制软材、制粒、干燥、整粒,即得。

图 1 健肝颗粒的 HPLC图

3 方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil-C18柱 (250 mm×4.6 mm,5um),流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液 (20∶80),流速 0.8 ml/min,检测波长 336nm,柱温 30℃,进样量 20μl。在此色谱条件下,添加剂无干扰。色谱图见图 1。由图可见,在此色谱条件下,绿原酸的保留时间为 7.9 min出峰良好,无干扰。

3.2 溶液的制备

3.2.1 标准品溶液 精密称取绿原酸对照品适量,加 50%甲醇溶解、稀释、定容,制成 1.806 mg/ml的储备液。

3.2.2 供试品溶液 取供试品约 1 g,研成细粉,精密称定,置 25 ml棕色容量瓶中,加 50%甲醇定容,摇匀,超声 30 min后取出,放至室温,定容,摇匀,取 5 ml离心,取上清液用针式过滤器过滤,进样。

3.2.3 阴性样品溶液 除绵茵陈外,其余各药按处方比例依工艺制成阴性样品,再按供试品溶液制备方法,制得阴性供试品溶液。

3.3 系统适用性实验

分别精密吸取对照品、供试品溶液、阴性对照品溶液,在上述色谱条件下进样,记录色谱图,结果绿原酸色谱峰与其他杂质峰得到较好的分离,分离度均大于1.5,阴性对照无干扰,色谱图见图 1。

3.4 线性关系

分别精密量取绿原酸对照品贮备液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置 10 ml容量瓶中 ,用甲醇稀释到刻度线制成对照品溶液,分别进样,以浓度为横坐标 (X),峰面积为纵坐标 (Y),进行线性回归,得绿原酸的标准曲线为 y=70900x+62527(n=6,r=0.9995),线性范围是 9.03～180.6ug。

3.5 回收率试验

取 6份已知含量的样品适量,加入一定含量的对照品溶液,按“供试品溶液的制备”项下处理,在上述色谱条件下,测定加样回收供试品溶液中绿原酸的含量。计算绿原酸加回收率,结果见表 1。

表 1 绿原酸的加样回收率试验结果 (n=6)

3.6 精密度试验

取一份中间浓度的对照品溶液,分别进样 6次,测得绿原酸的峰面积 RSD为 0.74%。

3.7 稳定性试验

取一份样品,按“供试品溶液的制备”项下制备,分别在 0,1,2,3,4,5 h依法测定,记录色谱峰的峰面积,绿原酸的 RSD为 0.27%。表明供试品溶液在 5 h内稳定。

3.8 重复性试验

取同一批样品 6份,分别按“供试品溶液的制备”项下制备,测定峰面积,计算含量,绿原酸的 RSD为1.96%,结果表明重复性良好。

3.9 样品含量测定

取三份样品,分别按“供试品溶液的制备”项下操作,测得其中绿原酸含量分别为 0.4061 mg/g、0.4056 mg/g、0.4059 mg/g。

4 讨论

4.1 本法根据健肝颗粒中绵茵陈成分绿原酸的紫外光谱选定 336 nm作为测定波长;而选用乙腈-0.4%磷酸溶液 (20：80)作为流动相,可使基线更加平稳,在 7.9 min出峰,峰形好,分离效果也好在选定的色谱条件下,可排除其他成分的干扰。本实验采用甲醇与样品溶液体积比为 5：5进行提取绿原酸,获得较好的效果。本法用于检测健肝颗粒中绵茵陈成分绿原酸的含量结果准确可靠。

4.2 健肝颗粒由中药绵茵陈、田基黄、甘草等组成,该方具有清热利湿、散瘀消肿之功效,用于急慢性肝炎,尤其对病毒性肝炎有特殊疗效。绵茵陈是方中君药。绿原酸是绵茵陈的主要活性成分之一,具有利胆、抗菌、清除自由基、抗氧化等多种药理作用[2]。绿原酸抗氧化机理为其分子的酚羟基与有害自由基反应变成较稳定的半醌式自由基,从而终止有害自由基的链式反应。同时,绿原酸也能通过自身的还原性质直接给电子消耗掉有害自由基[3]。由于影响中成药制剂有效成分含量的因素较多,例如不同产地,不同采集时间得到的中药材其活性成分相差较大,制备工艺中温湿度、液体用量、提取时间等对制剂质量均有一定的影响,因此,检测制剂中有效成分的含量以保证疗效是十分必要和可行的。

[1] 李忠.高效液相色谱法测定病毒清颗粒中绿原酸的含量.中国药师 ,2005,5(8)：393-394.

[2] 任荣,李正翔,李彬,等.HPLC法测定凉血化斑颗粒剂中绿原酸的含量.中国医院用药评价和分析,2007,7(6)：441-443.

[3] 童珊珊,徐亚萍,金花,等.绵茵陈提取液中绿原酸的测定及其抗氧化活性研究.江苏中医药,2009,41(4)：57-59.

545005广西医科大学第四附属医院