大孔树脂纯化枸骨叶总皂苷及其油脂抗氧化活性研究

曾超珍 刘志祥 李军龙

(中南林业科技大学生命科学与技术学院，长沙 410004)

大孔树脂纯化枸骨叶总皂苷及其油脂抗氧化活性研究

曾超珍 刘志祥 李军龙

(中南林业科技大学生命科学与技术学院，长沙 410004)

探讨枸骨叶总皂苷分离纯化的最佳工艺条件及其油脂抗氧化作用，采用6因素5水平正交设计法考察洗脱液浓度、洗脱时间、pH值等因素对纯化的影响。用紫外分光光度法测定总皂苷的含量，计算吸附量、解吸率和枸骨总皂苷的含量，最后确定最佳工艺条件;通过碘量法检测枸骨叶总皂苷抗氧化活性。结果表明，AB－8树脂纯化枸骨叶总皂苷的最佳工艺为吸附时间5 h，药液pH值为4、洗脱液固比为10∶1、洗脱液pH值为5、洗脱液乙醇体积分数为80%、解吸振荡时间3 h。枸骨叶总皂苷对猪油具有较强的抗氧化活性，且具有剂量效应关系。

枸骨叶 总皂苷 大孔树脂 分离纯化 抗氧化

枸骨叶为冬青科植物枸骨(Ilex Cornuta Lindl)的叶，主产于河南、湖北、湖南、安徽、江苏、浙江、江西、福建等地，具有凉血、退虚热、强腰膝等功效。枸骨叶主要含冬青苷I甲酯(ilexoside I methyl ester)、冬青苷Ⅱ(ilesosideⅡ)、苦丁茶苷(comutaside)甲、乙、丙、丁等皂苷类成分［1－3］。现代药理研究表明其具有抗生育、抗氧化、扩张冠状动脉、降血压、抗菌等作用。

大孔树脂是一类有机高分子聚合物吸附剂，主要通过物理作用从溶液中有选择地吸附有机物质，从而达到分离纯化的目的，它具有孔径大、比表面积高、物理化学性质稳定、吸附选择性强、处理量大、再生简便、价廉、溶剂易回收、无污染等优点，在环境、食品、生物医药等领域得到了广泛的应用［4－9］。AB－8型大孔树脂为聚苯乙烯型、弱极性聚合物吸附剂，研究表明其对皂苷类物质的分离、富集能力较好［10］。

本文主要探讨AB－8型大孔树脂分离纯化枸骨叶总皂苷的最佳工艺条件，并以食用油脂过氧化值(POV)为测定指标，研究枸骨叶总皂苷的抗氧化作用，同时通过选择添加合适的增效剂用于增加其抗氧化活性，以期为合理利用枸骨叶资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸骨叶:采于中南林业科技大学，除去杂质，干燥粉碎，过100目筛，备用。

AB－8型大孔吸附树脂:南开大学化工厂;人参皂苷Re对照品:上海医药化学试剂公司;猪油:市售;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

722型光栅分光光度计:北京中兴伟业仪器有限公司;R201D－Ⅱ型旋转蒸发仪:郑州长城科工贸有限公司;HS.2型电热恒温水浴锅:上海精密科学仪器有限公司;B135－S型电子分析天平:梅特勒－托利多仪器有限公司;FD－1A型冷冻干燥机:北京博医实验仪器公司;FW177型中草药粉碎机:天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的制备

精密称取人参皂苷标准品5.0 mg，加甲醇溶解，于10 mL容量瓶中定容，备用。分别移取标准品溶液 0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 mL，分别加入 5 支干燥具塞试管中，水浴挥干溶剂，各加入新鲜配制的5%香草醛—冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于60℃恒温水浴加热15 min，取出，流水冷却2 min，加冰醋酸5 mL，摇匀，在554 nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，人参皂苷Re(mg)为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程:Y=2.463X－0.010 8，r=0.999 7，结果表明，人参皂苷 Re在 0.03 ～0.09 mg范围内线性关系良好。

1.3.2 样品液的制备

称取枸骨叶粉20 g→80%乙醇浸提(按m∶V=1∶10)→浸提液加热蒸发浓缩(将乙醇蒸干)→石油醚萃取→加水定容到200 mL即得皂苷供试液→冷藏备用。(石油醚萃取:取浓缩液用石油醚充分萃取，去除脂类、色素等杂质。)

1.3.3 总皂苷含量的测定

将提取液用80%的乙醇定容至200 mL，取样在波长554 nm，按照1.3.1方法测定其吸光度，代入回归方程得出样品中总皂苷的浓度。

1.4 AB－8树脂纯化工艺研究

1.4.1 大孔树脂预处理

95%乙醇浸泡24 h→用95%乙醇清洗树脂至流出液与水混合(体积比为1∶5)不呈白色浑浊→用水洗至无醇味→5%HCl溶液通过树脂柱，浸泡2～4 h→水洗至中性→0.5 mol/L NaOH溶液通过树脂柱，浸泡2 ～4 h→水洗至中性，备用［11］。

1.4.2 正交试验

预试验结果表明吸附时间、原药液pH值、洗脱时的液固比例、洗脱液pH值、洗脱液(乙醇)体积分数、洗脱时间等6个因素对AB－8大孔树脂纯化总皂苷的吸附解吸影响比较显著，所以静态试验主要考察以上6因素对工艺的影响，设计6因素5水平的正交试验，因素水平见表1。

表1 因素水平表

1.4.3 结果计算

按表2［L25(56)正交表］进行试验，每次称取1 g预处理好的树脂置于200 mL具塞锥形瓶中，精密移取备用药液20 mL，加到锥形瓶中，于室温水浴恒温振荡箱中振摇24 h进行充分吸附，按1.3.3方法测溶液总皂苷浓度;按下述公式(1)(2)计算吸附量及解吸率。

式中:C0为母液质量浓度/mg/mL;C1为吸附后剩余溶液质量浓度/mg/mL;C2为解吸液质量浓度/mg/mL;V1为所加入药液体积/mL;V2为洗脱液体积/mL;m为树脂质量/g。解吸后得总皂苷量按下式计算:

表2 正交试验方案及结果

1.5 总皂苷油脂抗氧化试验

为了考察不同浓度枸骨叶总皂苷以及与VC、VE、柠檬酸的协同抗油脂氧化性能，本试验选用猪油为材料进行油脂抗氧化试验。

称取2～3 g油样(称准至0.000 2 g)于碘量瓶中(对于固态样品应先用索氏提取器将样品中油脂提取出来)，加30 mL三氯甲烷－冰乙酸混合液，使样品完全溶解。加入1mL饱和碘化钾溶液，紧密塞好瓶盖，并轻轻振摇0.5 min，然后在暗处放置3min，取出加100 mL水，摇匀，立即用0.01 mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定，至淡黄色时，加1 mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为终点。取同量三氯甲烷－冰乙酸溶液、碘化钾溶液、水，按同一做法，做试剂空白试验。过氧化值计算公式:

POV值=(A－B)×N×0.126 9×100/M (4)

式中:A为样品消耗硫代硫酸钠标准溶液体积/mL;B为试剂空白消耗硫代硫酸钠标准溶液体积/mL;N为硫代硫酸钠标准溶液的摩尔浓度/mol/L;M为样品质量/g;0.126 9为1 mol/L硫代硫酸钠1 mL相当于碘的克数。

2 结果与分析

2.1 AB－8大孔树脂纯化枸骨叶总皂苷的工艺条件确定

以总皂苷量为评价指标，进行正交试验结果分析，见表2。

由正交试验结果表2的直观分析可以看出，R值越大，因素的影响越显著，A、B、C、D、E、F这6个因素的影响作用大小顺序为:E＞A＞F＞D＞B ＞C。即洗脱液浓度＞吸附时间＞洗脱时间＞洗脱液pH＞原药液pH ＞洗脱时的液固比;纯化的最佳工艺组合是:A4B1C4D1E5F3，即吸附时间5 h、原药液pH 4、洗脱时的液固比20∶1、洗脱液pH 5、洗脱液(乙醇)体积分数为80%、洗脱时间3 h。

2.2 方差分析

将表2正交试验结果进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析表

以总皂苷量为评价指标进行方差分析表明，因素E(洗脱液的浓度)对纯化工艺影响最大，具有显著性差异。其他因素对纯化工艺的影响较小，无显著性差异。这与正交试验的极差直观分析的结果相吻合。其中因素B、C(原药液pH、洗脱液的液固比)对工艺影响最小，从节省试剂用量的角度考虑，采用液固比为10∶1，即因素C的2水平。综合考虑可以得出最佳工艺组A4B1C2D1E5F3。AB－8树脂纯化枸骨叶总皂苷的最佳工艺为:即吸附时间5 h、药液pH值为4、洗脱液固比为10∶1、洗脱液pH值为5、洗脱液乙醇体积分数为80%、解吸振荡时间3 h。

2.3 最优工艺验证试验

由于优选的纯化工艺A4B1C2D1E5F3未包括在正交设计的25次试验中，故对其进行验证试验，按照确定的最佳工艺进行，其他条件与正交试验相同，结果在最佳工艺组合的条件下，AB－8树脂的吸附量的平均值为6.11 mg/g，解吸率的平均值为91%，每使用1 g树脂进行处理药物，可得总皂苷量的平均值为 5.5 mg(n=6，RSD=0.65%)表明经该纯化工艺可使AB－8树脂吸附量大，解吸率比较高，皂苷量较多，且工艺的稳定性良好。

2.4 大孔树脂重复使用次数

由表4可以看出:试验确定的最佳条件下，AB－8树脂的重复使用性能较好，重复使用5次后，对总皂苷的吸附率下降4.2%，还可以继续使用。

表4 树脂重复使用次数对吸附效果的影响

2.5 分离的枸骨叶总皂苷的纯度考察

取枸骨叶样品液(总皂苷含量为15.7 mg/mL)20 mL平行3份稀释5倍，按照最佳的分离工艺，在AB－8树脂上纯化枸骨叶总皂苷，收集洗液，定容，按照1.3.3方法测定总皂苷的含量，取10 mL，水浴蒸干后于105℃干燥至恒重，测定干膏收率，计算总皂苷的纯度，结果见表5。

表5 总皂苷纯度测定结果

从表5可以看出，经AB－8大孔树脂处理后的总皂苷纯度可达25%以上，且具有良好的重现性。

2.6 枸骨叶皂苷油脂抗氧化试验

2.6.1 不同添加量枸骨叶皂苷对油脂过氧化值的影响

油脂暴露在空气中易氧化形成自由基，自由基继续与氧反应生成自由基和过氧化物，自由基的链式反应再使油脂继续氧化。可以测定油脂的POV值来评价其氧化程度。POV越高，氧化程度越高。由图1可知，随着时间的延长，POV值不断增大，与对照相比，添加枸骨叶总皂苷的POV值增加的速度较为缓慢，其中以0.08%枸骨叶总皂苷的增加速度最慢，达12 d时POV值为30.5 mmol/kg，即对油脂抗氧化活性效果最强。同时抗氧化能力有剂量效应关系，即随着剂量的增大，延缓猪油的过氧化反应，随着枸骨叶总皂苷加入量的增大，其抑制猪油生成氢过氧化物的能力也加强，亦即其抗氧化效果增强。枸骨叶总皂苷的这种抗氧化性与其他的一些天然抗氧化提取物相同。

图1 不同添加量枸骨叶总皂苷对油脂抗氧化作用

2.6.2 枸骨叶总皂苷与其他物质的协同抗氧化作用

由于复合抗氧化剂在发挥抗氧化作用时，各组分间可能发生一系列复杂的反应，可表现协同增效的作用。从图2可知，柠檬酸、抗坏血酸、VE对枸骨叶总皂苷的抗氧化作用均有协同增效作用，并且抗坏血酸的增效作用最强。协同增效的强弱顺序为:VC＞VE＞柠檬酸。同时，从试验中还可以看出，其抗氧化能力强于单独使用时的枸骨叶总皂苷。

图2 枸骨叶总皂苷与柠檬酸、VC、VE混合使用抗氧化性能的比较

3 结论

大孔树脂纯化原理为吸附作用和分子筛作用，吸附的产生是由于范德华力或氢键，分子筛作用是由于其多孔结构，故吸附力较弱，有机溶剂容易洗脱;大孔吸附树脂具有工艺操作简单，产品纯度高，树脂可再生等优点。AB－8型树脂对枸骨叶总皂苷有较好的吸附和洗脱效果，用其纯化枸骨叶皂苷是可行的;AB－8树脂纯化枸骨叶总皂苷的最佳工艺为:吸附时间5 h、药液 pH值为4、洗脱液固比为10∶1、洗脱液 pH值为5、洗脱液乙醇体积分数为80%、解吸振荡时间3 h。结果表明，经过AB－8树脂处理纯化的枸骨叶总皂苷纯度达25%以上，并且该树脂的重复使用性能较好。

枸骨叶总皂苷对油脂抗氧化试验表明，它对猪油有较强的抗氧化效果，总皂苷与猪油的抗氧化能力有剂量效应关系，即随着剂量的增大，延缓猪油的过氧化反应，其抑制猪油生成氢过氧化物也加强，即其抗氧化效果增强。VC、VE、柠檬酸对枸骨叶总皂苷油脂抗氧化均具有协同增效作用。

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Research on Purification Technology of Saponins from Folium Ilicis Cornutae by Macroporous Resin and Its Antioxidative Activity on Oil

Zeng Chaozhen Liu Zhixiang Li Junlong
(College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004)

In this paper，the optimal formula and conditions on separation and purification of saponins from Folium Ilicis Cornutae by macroporous resin and its antioxidative activity on oil were studied.An orthogonal experiment of 6 factors and 5 levels was used to study the effects on separation and purification including eluent concentration，elution time，pH value，etc.The content of saponins in Folium Ilicis Cornutae was determined by ultraviolet spectrophotometry.Then，the adsorption capacity，the rate of desorption and the concentration of saponins were calculated to determine the suitable conditions.Antioxidation activity of saponins from Folium Ilicis Cornutae was studied by the iodine method.The results showed that the optimized separation and purification technology of saponins from Folium Ilicis Cornutae by AB －8 was as follows:time of 5 h，solution pH value of 4，eluent－solid ratio of 10∶1，eluent pH value of 5，the concentration of 80%ethanol eluent，and desorption oscillation time of 3 h.So，saponins have strong antioxidation activity to lard and its activity is in proportion to saponins in dose.

Folium Ilicis Cornutae，saponins，macroporous resin，separation and purification，antioxidation

TS221

A

1003－0174(2011)08－0045－05

中南林业科技大学青年科学研究基金(06007B)

2010－10－19

曾超珍，女，1978年出生，讲师，药用植物资源与利用