曲美他嗪对心肌梗死大鼠短期心肌保护作用的研究*

罗艳婷， 刘金来△ ， 陈 飞， 谭 文

(1中山大学附属第三医院心内科，广东 广州 510630；2凯法生物医药有限公司，广东 东莞 523808；3华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006)

曲美他嗪对心肌梗死大鼠短期心肌保护作用的研究*

罗艳婷1， 刘金来1△， 陈 飞2， 谭 文3

(1中山大学附属第三医院心内科，广东 广州 510630；2凯法生物医药有限公司，广东 东莞 523808；3华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006)

目的探讨曲美他嗪对大鼠心肌梗死心脏的保护作用及其部分作用机制。方法90只SPF级SD大鼠随机分为3组：假手术组(n=30)、心肌梗死组(n=30)和曲美他嗪治疗组(n=30)。心肌梗死组和曲美他嗪治疗组在高位结扎左冠状动脉前降支，制成心肌梗死模型。假手术组及心肌梗死组在术前灌胃给予生理盐水，曲美他嗪组灌胃给予曲美他嗪(3 mg/kg，每天2次)，连续治疗1周、2周和4周。冠脉结扎后8 h、24 h和48 h检测血清心肌肌钙蛋白I浓度。在治疗后1周、2周和4周后测量平均动脉压、心率、收缩期心室压力最大上升速率(+dp/dtmax)及舒张期左室压力最大下降速率(-dp/dtmax)，并检测心肌梗死面积，TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数。结果在连续给药2周及4周后曲美他嗪组与心肌梗死组相比，能显著改善大鼠的心脏收缩功能[第2周：+dp/dtmax(8 101±990)mmHg/svs(5 868±1 302)mmHg/s; 第4周：+dp/dtmax(7 629±1 181) mmHg/svs(5 620±454) mmHg/s]及舒张功能[第2周：-dp/dtmax(6 514±1 558) mmHg/svs(4 750±1 463) mmHg/s；第4周：(5 883±1 379) mmHg/svs(4 256±731) mmHg/s](均Plt;0.01)，不影响心率及平均动脉压(Pgt;0.05); 曲美他嗪可降低大鼠心肌梗死后24 h血清心肌肌钙蛋白I水平(Plt;0.01)，减少大鼠心肌梗死面积(Plt;0.01)，并抑制心肌缺血损伤区的心肌细胞凋亡(Plt;0.01)。结论曲美他嗪对心肌梗死后大鼠具有明确的心脏保护作用，抑制心肌梗死后缺血损伤区细胞凋亡是其心肌保护作用的机制之一。

曲美他嗪； 心肌梗死； 细胞凋亡； 大鼠

曲美他嗪作为一种哌嗪类的新型代谢类细胞保护剂，已被证实对慢性稳定性心绞痛治疗有效[1]，并在急性心肌梗死中有较好的保护作用[2]。然而曲美他嗪在心肌梗死亚急性期的治疗效果及其对血流动力学的影响仍未明确。本实验在大鼠心肌梗死模型中短期给予曲美他嗪治疗，观察其对心肌梗死大鼠血流动力学、心肌梗死面积的影响，并初步探讨曲美他嗪对心肌梗死模型中缺血区及损伤区细胞凋亡的影响。

材 料 和 方 法

1材料

SPF级SD大鼠90只，雌雄各半[由广东省动物实验中心提供，体重180～350 g，批号SCK (粤) 2008 -0002]；盐酸曲美他嗪(施维雅制药有限公司，批号9A3560)；伊红(Amersco)；Triton X-100(Amersco，批号9002-93-1)。凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(南京凯基生物公司，批号KGA7032)。ML870 PowerLab 8/30生理记录仪(ADInstruments)、MLT844压力传感器(ADInstruments)、Millar导管(型号SPR-52A，3.5F，Millar Instruments)；肢体Ⅱ导联(MLA1230, 1.5 mm，ADInstruments)；TKR-200C呼吸机(江西省特力麻醉呼吸设备有限公司)；Olympus CX31显微镜(Olympus)；ADVIR Centaur CP全自动化学发光分析仪(西门子公司)；Image-Pro Plus 6.0图像分析系统(Media Cybernetics)。

2方法

2.1动物分组及给药方式 90只SPF级SD大鼠，雌雄各半，随机分为假手术组(sham,S组) (n=30)、心肌梗死组(myocardial infarction,MI组) (n=30)和心肌梗死曲美他嗪治疗组(MI+trimetazidine,MT组) (n=30)。假手术组只穿线、不结扎；心肌梗死组及曲美他嗪治疗组造心肌梗死模型，其中心肌梗死组在结扎前10 min，结扎后每天2次灌胃给予生理盐水，按2 mL/kg给予；曲美他嗪治疗组，在结扎前1 h及结扎后每天2次灌胃给药(曲美他嗪3 mg/kg)。在手术后8 h、24 h及48 h检测血清心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin,cTnI)浓度；各组在连续给药1周(n=10)、2周(n=10)及4周(n=10)后，测量大鼠心室内压、心率、平均动脉压和心电图，处死动物后测定心肌梗死面积、心肌细胞凋亡等指标。

2.2模型制备 3%戊巴比妥钠溶液1.5 mL/kg腹腔注射麻醉，固定大鼠四肢、头部。连接心电图导联，分别为右上肢、左下肢、腹部(肢体Ⅱ导联)。经口气管插管，使用麻醉喉镜暴露大鼠喉部，并插入大小合适的气管插管，接小动物呼吸机，设潮气量20～30 mL/kg，频率60 min。开胸、结扎冠脉：胸部去毛，碘伏消毒、铺巾，沿4、5肋间作斜切口，暴露心脏，剥脱心包，暴露左心耳与肺动脉圆锥间的静脉(冠脉主干在此与静脉伴行)，以此静脉为标记进行结扎，用5/0带线缝合针在左心耳下3～5 mm、静脉周围1.5～2 mm左冠状动脉处缝1针，结扎丝线(假手术组只穿线不结扎)。关胸、抽吸腔内气体保持负压、逐层缝合。冠脉结扎成功标志：结扎5 min后ST段弓背抬高或病理性Q波形成；R波振幅减低；结扎区心肌紫绀。

2.3左心室内压、心率及动脉压测量 左心室内插管：Millar导管定标。行颈正中切口约3 cm，钝性分离皮下组织和颈前正中肌肉，分离右侧颈总动脉，穿线(分离动脉时尽量避免牵拉迷走神经)，结扎右颈总动脉远心端，并在近心端置小动脉夹，穿线备用。在近心端结扎处呈45°剪一“V”型小口，插入Millar导管后松开动脉夹，当出现典型心室内压波形，扎紧近心端。Millar导管记录收缩期左心室压力最大上升速率(the maximum rising rate of left ventricle systolic pressure,+dp/dtmax)、舒张期左心室压力最大下降速率(the maximum descending rate of left ventricle diastolic pressure,-dp/dtmax)及心率(heart rate，HR)。

右侧股动脉插管：压力换能器定标。切开右侧股部皮肤，分离股动脉，穿线、结扎远心端，方法同上。当导管插入动脉后，出现稳定的动脉波形后，扎紧近心端。记录平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)。

2.4血清cTnI测定 通过剪尾取血法在结扎冠脉前、结扎冠脉后8 h、24 h及48 h取血约1 mL置于干燥管中，在室温下静置30 min后，以3 000 r/min的速度离心20 min，取上清液，做好标记，存放在-80 ℃超低温冰箱中保存，统一检测。检测时将低温保存的大鼠血清复温，用振荡仪振荡1 min，为令血清中的测量值在仪器的测量范围内(0～50 μg/L)，需将血清稀释5倍。取血清80 μL及生理盐水320 μL充分混合(稀释5倍)，避免液面中有气泡形成。样品检测：将样品置入全自动化学发光分析仪中，可自动检测血清中cTnI。

2.5心肌梗死面积测量 取结扎部位以下5～6 mm心肌组织常规石蜡包埋切片，并进行HE染色。数码相机拍摄左心室横截面切片，使用Image Pro-Plus 6.0图像分析系统测量各弧长、周长、面积厚度，按照公式计算梗死面积[3]，以瘢痕弧长百分数 (%)=瘢痕弧长/[(外周长+内周长)/2]×100%。

2.6心肌细胞凋亡检测 采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡。取结扎部位以下5～6 mm心肌组织常规石蜡包埋切片。切片常规脱蜡至水，加入蛋白酶K工作液，室温反应15～30 min(根据组织情况调整反应时间)，PBS液漂洗5 min×2次，浸入封闭液(3%H2O2溶液甲醇)室温15～25 ℃封闭10 min，PBS液漂洗5 min×2次后进入标记反应。预处理好的样本PBS液漂洗5 min×2次，样本周围用吸水纸吸干，每个样本滴加50 μL TdT酶反应液，加盖玻片37 ℃避光湿润反应60 min；PBS液漂洗5 min×3次，样本周围用吸水纸吸干，滴加50 μL Strepravidin-HRP工作液，加盖玻片37 ℃避光湿润反应30 min，PBS液漂洗5 min×3次，0.2%Triton X-100/PBS室温反应5 min；PBS液漂洗5 min×2次，滴加50 μL DAB工作液，室温显色反应10 min，PBS液漂洗5 min×3次，苏木素复染，脱水、透明封片。显微镜下观察、拍照。阳性细胞显示为棕黄色。细胞凋亡指数(apoptotic index)的计算方法为，每张切片数5个以上的高倍视野，不少于100个细胞，分别计数心肌凋亡细胞数，以凋亡细胞占所计数细胞的百分比作为它们各自细胞凋亡率。

3统计学处理

结 果

1曲美他嗪对心肌梗死大鼠血流动力学的影响

在心肌梗死后1周、2周及4周时，曲美他嗪组及心肌梗死组大鼠的心肌收缩功能(+dp/dtmax)及舒张功能(-dp/dtmax)均较假手术组有显著下降。在连续治疗1周时，曲美他嗪组的+dp/dtmax、-dp/dtmax与心肌梗死组间+dp/dtmax、-dp/dtmax相比无显著差异(Pgt;0.05)。在心肌梗死治疗2周后，曲美他嗪组与心肌梗死组相比均能显著增加+dp/dtmax(Plt;0.01)，并能够显著增加-dp/dtmax(Plt;0.01)。在心肌梗死治疗4周后，曲美他嗪组与心肌梗死组相比均能显著增加+dp/dtmax(Plt;0.01)及-dp/dtmax(Plt;0.01)。曲美他嗪在改善心肌梗死大鼠心功能的同时，对其心率及平均动脉压并无显著影响 (Pgt;0.05)，见表1。

表1 曲美他嗪治疗1、2和4周后血流动力学改变

2曲美他嗪对血清cTnI的影响

假手术组大鼠在手术后24 h，血清cTnI并无显著升高，而其它2组造模后24 h与假手术组相比，血清cTnI显著升高(Plt;0.01)。在冠脉结扎后8 h，与心肌梗死组比较，曲美他嗪组血清cTnI升高程度无显著差异(Pgt;0.05)。在冠脉结扎后24 h，曲美他嗪组血清cTnI浓度较冠脉结扎后8 h有所下降，而心肌梗死组与结扎后8 h相比仍有继续升高。结扎后24 h，与心肌梗死组比较，曲美他嗪组血清cTnI浓度显著降低(Plt;0.01)。在结扎后48 h，曲美他嗪组血清cTnI水平与心肌梗死组比较，无显著差异(Pgt;0.05)，见图1。

Figure 1. Comparison of serum cTnI the in three groups at 8 h, 24 h and 48 h±s.n=8.**Plt; 0.01 vs MI group.

3曲美他嗪对心肌梗死面积的影响

HE染色见正常心肌呈紫红色，梗死心肌呈蓝色，被弹性纤维组织替代，心肌变薄，见图1。以瘢痕弧长的百分比表示心肌梗死面积，与心肌梗死组比较，曲美他嗪治疗组能显著减少心肌梗死面积(Plt;0.01)，见图2。

Figure 2. The myocardial infarction area in the three groups. A: HE staining of myocardium(×4); B: comparison of myocardial infarction area in the three groups±s.n=6.**Plt; 0.01 vs MI group.

4曲美他嗪对心肌细胞凋亡的影响

心肌梗死组的心肌细胞凋亡指数较曲美他嗪组显著增加(Plt;0.01)。心肌梗死组与曲美他嗪组心肌细胞凋亡指数分别为(7.930%±0.006%)和(1.500%±0.004%)，见图3。图3显示染成深棕黄色细胞为凋亡细胞，主要分布在损伤区及缺血区域。心肌梗死组的凋亡细胞较曲美他嗪组显著增多，而曲美他嗪组仅在心肌梗死周边区域偶见散在的少量心肌梗死细胞。

Figure 3. Myocardial apoptosis of the three groups. A: the apoptotic cardiomyocytes detected by TUNEL assay (TUNEL staining, ×400);B:apoptotic index of cardiomyocytes in the three groups±s.n=3.**Plt; 0.01 vs MI group.

讨 论

心肌梗死早期，因坏死心肌及缺血顿抑心肌收缩功能缺失，常导致心脏收缩功能下降。心肌梗死后出现心肌能量缺乏、钙超载、自由基生成增多、酸中毒引起的心肌缺血损伤是病情持续加重的主要原因。Kantor等[4]研究发现，曲美他嗪的主要作用机制是通过选择性抑制线粒体长链3-酮脂酰辅酶A硫解酶来抑制长链脂肪酸氧化，此过程并不影响三羧酸循环和氧化磷酸化。通过抑制耗氧多的游离脂肪酸氧化，转向葡萄糖氧化，利用有限的氧产生更多的ATP，增加心脏收缩功能。此外，曲美他嗪还可保护线粒体功能，通过减轻细胞内酸中毒、钙超载、清除氧自由基和抗氧化作用，抑制中性粒细胞聚集，来减小心肌梗死的面积[5]。一些学者认为，曲美他嗪可与线粒体膜上的可通透性蛋白结合并使之失活，抑制缺氧时Ca2+内流所引起的线粒体肿胀，以增强线粒体抗缺血能力[6]。曲美他嗪对心肌缺血具有明显的治疗作用，与硝酸酯类、β受体阻滞剂及钙离子拮抗剂不同，在抗心肌缺血时，并不影响血流动力学参数和心肌耗氧量[4,7]。本实验在大鼠心肌梗死模型中，证实了给予曲美他嗪1-4周治疗，可改善心肌梗死大鼠急性期及亚急性期心脏的收缩功能及舒张功能，且不影响其心率及平均动脉压，并可减少心肌梗死面积，从而证实了曲美他嗪在心肌梗死的急性期及亚急性期有明确的心脏保护作用。

细胞凋亡(apoptosis)是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。Kajstura等[8]实验发现在心肌梗死2 h，大量的心肌细胞凋亡开始出现，4-5 h后细胞凋亡仍然是细胞损害的主要形式，而细胞坏死紧接其后，1 d时达高峰，而Palojoki等[9]研究亦证实，心肌梗死24 h，梗死区和梗死周边的心肌细胞凋亡升高，4周后逐渐下降并伴有非梗死区细胞凋亡出现。由此可见，细胞凋亡为心肌梗死进展的重要因素之一。本实验中初步发现曲美他嗪可以减少心肌缺血区域及损伤区域的心肌细胞凋亡，说明抑制细胞凋亡可能是曲美他嗪保护缺血心肌的重要机制之一。

总之，本研究表明曲美他嗪具有明确的抗心肌缺血、改善心肌梗死后心功能的作用，并能够抑制心肌梗死后缺血区及损伤区的细胞凋亡，减少心肌梗死面积。这有助于心肌梗死后心室重构的防治及促进心功能的恢复。

[1] Szwed H, Sadowski Z, Elikowski W, et al. Combination treatment in stable effort angina using trimetazidine and metoprolol.Results of a randomized, double -blind,multicentre study (TRIMPOL Ⅱ)[J]. Eur Heart J, 2001, 22(24)：2267-2274.

[2] 罗 文, 李悦山. 曲美他嗪与帕瑞昔布联合给药对急性心肌梗死期大鼠心脏的保护作用[J]. 中国病理生理杂志, 2011, 27(8):1502-1507.

[3] Takagawa J, Zhang Y, Wong ML, et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model:comparison of area- and length-based approaches [J]. J Appl Physiol, 2007, 102(6): 2104-2111.

[4] Kantor PF, Lucien A, Kozak R, et al. The antianginal drug trimetazidine shifts cardiac energy metabolism from fatty acid oxidation to glucose oxidation by inhibiting mitochondrial long-chain 3-ketoacyl coenzyme A thiolase [J]. Circ Res, 2000, 86(5): 580 -588.

[5] EI Banani H, Bernard M, Baetz D, et al. Changes in intracellular sodium and pH during ischaemia-reperfusion are attenuated by trimetazidine. Comparison between low-and zero-flow ischaemia [J]. Cardiovasc Res, 2000, 47(4):688- 696.

[6] Minners J, vandenBos EJ, Yellon DM, et al. Dinitrophenol，cyclosporin A, and trimetazidine modulate preconditioning in the isoluted rat heart: support for a mitochondrial role in cardioprotection[J]. Cardiovasc Res, 2000, 47(1):68-73.

[7] 中国曲美他嗪多中心临床研究协作组. 曲美他嗪对稳定性劳力型心绞痛的疗效观察[J]. 中华心血管病杂志, 2000, 28(5):339-441.

[8] Kajstura J,Cheng W,Reiss K,et al. Apoptotic and necrotic myocyte cell deaths are independent contributing variables of infarct size in rats[J]. Lab Invest, 1996,74(1):86-107.

[9] Palojoki E, Saraste A, Eriksson A, et al. Cardiomyocyte apoptosis and ventricular remodeling after myocardial infarction in rats [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001, 280(6):H2726-H2731.

Short-termcardioprotectiveeffectsoftrimetazidineonacutemyocardialinfarctioninrats

LUO Yan-ting1, LIU Jin-lai1, CHEN Fei2, TAN Wen3

(1DepartmentofCardiology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2Key-PharmaBiomedicalCompany,Dongguan523808,China；3SchoolofBioscienceandBioengineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China.E-mail:lj.lai@medmail.com.cn)

AIM: To observe the myocardial protective effects of trimetazidine on myocardial infarction (MI) in Sprague-Dawley (SD) rats.METHODSNinety SD rats were randomly assigned to 3 groups (n=30 each): myocardial infarction group (MI group), MI+trimetazidine group (MT group) and sham group (S group). By permanently ligating the left anterior descending artery, the MI model was set up in the rats in MI group and MT group. Before and after setting up the MI model, normal saline was given to the rats in MI and S group by gavage. On the other hand, trimetazidine (3 mg/kg,twice per day) was given to the rats in MT group by gavage. At 8 h, 24 h and 48 h after applying trimetazidine, the serum level of cardiac troponin I (cTnI) was measured. At the 1st week, 2nd week and 4th week after treated with trimetazidine, the size of myocardial infarction, the maximum rising rate of the left ventricular systolic pressure (+dp/dtmax) and the maximum descending rate of the left ventricular diastolic pressure (-dp/dtmax) were measured. Also at the 1st week after applying trimetazidine, the cardiomyocyte apoptotic index was detected.RESULTSCompared with MI group 2 weeks after applying trimetazidine, +dp/dtmaxsignificantly increased in MT group [(8 101±990) mmHg/svs(5 868±1 302) mmHg/s,Plt;0.01], and -dp/dtmaxalso significantly increased in MT group [(6 514±1 558) mmHg/svs(4 750±1 463) mmHg/s,Plt;0.01]. Four weeks after applying trimetazidine, +dp/dtmaxsignificantly increased in MT group [(7 629±1 181) mmHg/svs(5 620±454) mmHg/s,Plt;0.01], and -dp/dtmaxalso significantly increased in MT group [(5 883±1 379) mmHg/svs(4 256±731) mmHg/s,Plt;0.01]. At 8 h and 48 h after applying trimetazidine, no statistically significant difference (Pgt;0.05) of serum cTnI between MI group and MT group was observed. However, at 24 h after applying trimetazidine, the serum level of cTnI decreased in MT group [(22.7±14.9) μg/L] as compared with MI group [(42.3±16.2) μg/L,Plt;0.01]. Aditionally, trimetazidine significantly decreased the infarction size of myocardium in MT group (0.248±0.052) as compared with MI group (0.362±0.082,Plt;0.01).CONCLUSIONTrimetazidine has short-term cardioprotective effects on the rats with acute MI by improving myocardial systolic and diastolic functions, reducing infarct size and inhibiting apoptosis.

Trimetazidine; Myocardial infarction; Apoptosis; Rats

1000-4718(2011)11-2072-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.005

2011-05-23

2011-09-16

广东省自然科学基金资助项目(No.07001556[11B])

△通讯作者 Tel：020-85252168；E-mail：lj.lai@medmail.com.cn