宁夏沙枣多糖的酶法提取工艺

王凯 王青

摘要：研究酶法提取宁夏沙枣（Ｅｌａｅａｇｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ Ｌ．）中多糖的提取工艺。在单因素试验的基础上，采用正交设计考察了不同ｐＨ值、酶的添加量、酸提时间对多糖提取率的影响。结果表明，最佳工艺条件为酶提ｐＨ值４．３８，添加酶的质量分数５％，酶提时间３ ｈ，酶提温度６０ ℃。最佳条件下多糖的提取率为72.93％。

关键词：宁夏沙枣；多糖；提取工艺；正交试验

中图分类号：Ｓ６６５．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）16－3368-03

Study on Enzymatic Extracting Conditions of Polysaccharide from

Elaeagnus angustifolia L. in Ningxia

ＷＡＮＧ Ｋａｉ１，ＷＡＮＧ Ｑｉｎｇ２

（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｅｉｆａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｈａｎｇｑｉｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｓｈａｎｇｑｉｕ ４７６１００， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ eｎｚｙｍａｔｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｅｌａｅａｇｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ L. ｉｎ Ｎｉｎｇｘｉａ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ， ｅｎｚｙｍｅ ｄｏｓａｇｅ， ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｏｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｅ． ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｗｅｒｅ ｐＨ ４．３８， ｅｎｚｙｍｅ ｄｏｓａｇｅ ５％，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ３ ｈ， ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ６０ ℃． Ｕｎｄｅｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｒａｔｅ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ 72.93％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｌａｅａｇｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ L.； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ

沙枣（Ｅｌａｅａｇｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ Ｌ．）又名银柳、香柳、桂香柳、七里香、红豆等，为胡颓子科胡颓子属落叶（或常绿）乔木或灌木［１］。主要分布在我国华北、西北等省区，且以西北荒漠、半荒漠地区为分布中心［２］。沙枣多糖在抗肿瘤、消炎、抗病毒、降血糖、降血脂、抗衰老、抗凝血、免疫调节等方面有生物活性作用［３］。廉宜君等［４］对新疆的沙枣多糖的提取进行了研究，但宁夏本地产沙枣多糖的提取尚无报道。该试验采用正交试验对宁夏沙枣多糖的酶法提取工艺进行研究，为制定更加经济的沙枣多糖提取工艺提供试验依据。

１材料与方法

１．１材料

７２２Ｓ型分光光度计、ＰＨＳ－３Ｃ型精密ｐＨ计、ＦＡ１００４Ｎ型电子分析天平、ＪＹ３００２型电子天平（均购自上海精密科学仪器有限公司）；ＫＡ－１０００型离心机（上海安亭科学仪器厂）；１０１型电热鼓风干燥箱（上海申光仪器仪表有限公司）。

沙枣，采于宁夏回族自治区银川市西夏区同心南路，６０℃干燥，磨碎，４０目过筛，制成沙枣粉；果胶酶（北京化工厂）、醋酸、醋酸钠、葡萄糖、浓硫酸、苯酚均为国产分析纯。

１．２方法

１．２．１标准曲线的绘制①苯酚的配制。称取一定量的苯酚固体，４５ ℃溶解为液体，加入１００ ｍＬ的圆底烧瓶中，再加０．０２ ｇ的铝片和０．０５ ｇ碳酸氢钠，常压蒸馏收集１８０～１８２ ℃馏分，得白色针状苯酚结晶。加一定体积去离子水溶解，配成质量分数为５％的苯酚溶液，避光贮藏备用。②标准葡萄糖溶液的配制。精密称取６０ ℃干燥至恒重的葡萄糖０．１００ ０ ｇ，用去离子水溶解并定容在１００ ｍＬ的容量瓶中，配制成浓度为１．０００ ０ ｍｇ／mＬ的标准葡萄糖溶液。③标准曲线的绘制。准确移取０．００、０．４０、０．８０、１．２０、１．６０、２．００、２．４０、２．８０ ｍＬ １．０００ ０ ｍｇ／ｍＬ标准葡萄糖溶液于１００ ｍＬ的容量瓶中，去离子水定容，摇匀。再分别精密移取上述８种浓度的溶液２．００ ｍＬ于１０ ｍＬ的具塞刻度试管中，加５％（m/m，下同）的苯酚溶液１．００ ｍＬ，混匀，再加浓硫酸５．００ ｍＬ，４０ ℃的水浴中恒温３０ ｍｉｎ，然后立即转移至冰水浴中冷却３０ ｍｉｎ，用试剂空白作参比，于４９０ ｎｍ波长处测定吸光度［５］，结果见表１。标准曲线的回归方程为：

Ａ＝６２．２２６ ０Ｃ－０．００１ ２，ｒ＝０．９９９ ７。标准曲线在０．０００～０．００７ ｍｇ／ｍＬ范围内线性良好。

１．２．２多糖提取工艺流程沙枣→６０ ℃烘干→去核→粉碎→热水浸提３０ ｍｉｎ→酶提→灭酶（８０ ℃，１ ｈ）→离心分离６ ｍｉｎ→稀释，定容→苯酚－硫酸法测吸光度。

１．２．３多糖含量的测定称０．５０ ｇ沙枣粉于５０ ｍＬ的具塞三角瓶，加去离子水１０ ｍＬ，摇匀，８０ ℃恒温３０ ｍｉｎ，冷却至室温，加入用缓冲溶液定容的果胶酶，５０ ℃水浴中恒温２ ｈ，然后８０ ℃恒温１ ｈ灭酶，离心得样品液，准确移取上清液０．１０ ｍＬ，定容至１００ ｍＬ的容量瓶中，再移取该液２．００ ｍＬ于１０ ｍＬ具塞刻度试管中，先加５％的苯酚溶液１．００ ｍＬ，混匀后加入浓硫酸５．００ ｍＬ。在４０ ℃水浴中恒温３０ ｍｉｎ，冰水浴中冷却３０ ｍｉｎ，以试剂空白做参比，测定其吸光度。用标准曲线计算多糖含量。多糖的提取率＝多糖的濃度／枣粉的浓度×１００％。

１．２．４酶种类的选取根据其他植物多糖提取累积的经验，选取果胶酶、纤维素酶及其两者的复合酶为参考因素，确定酶的种类。为了保证试验的准确性，做３次平行试验，结果都显示果胶酶的作用大于纤维素酶和复合酶，因此试验采用果胶酶。表２为３次试验结果的平均值。

２结果与分析

２．１单因素试验结果

２．１．１ｐＨ值对沙枣多糖提取率的影响适当的ｐＨ值下，静电作用维持了酶活性中心的最佳三维构象，促进了酶和底物的结合；ｐＨ值不同，酶与底物所带电荷不同，酶的立体构象以及酶与底物的亲和力不同，催化速度也就不同。称取沙枣粉０．５０ ｇ，加去离子水１０ ｍＬ，摇匀，８０ ℃恒温３０ ｍｉｎ，冷却至室温，准确移取用ｐＨ值为３．４０、３．８１、４．３８、４．９２的缓冲溶液配制的质量分数为２％的果胶酶５．００ ｍＬ，酶提温度５０℃、酶提时间２ ｈ条件下，按1.２．３的方法操作，研究不同ｐＨ值对沙枣多糖提取率的影响。结果见表３。由表可见，开始时随着ｐＨ值的增大，提取率也在增大；在ｐＨ值为３．８１时，提取率最大，为６３．６７％；随着ｐＨ值的继续增大，提取率开始下降，所以ｐＨ值选取３．８１。

２．１．２酶的添加量对沙枣多糖提取率的影响生化反应中，在底物浓度相同条件下，酶促反应速度与酶的初始浓度成正比。但即使酶浓度足够高，随底物浓度的升高，酶促反应速度并没有因此增加，反而受到抑制。称取沙枣粉０．５０ ｇ，加去离子水１０ ｍＬ，摇匀，８０ ℃恒温３０ ｍｉｎ，冷却至室温，再准确移取ｐＨ值为３．８１的缓冲溶液配制的质量分数为２％、３％、４％、５％的果胶酶５．００ ｍＬ，酶提温度５０ ℃、酶提时间２ ｈ条件下，按1.２．３的方法操作研究不同酶的添加量对沙枣多糖提取率的影响，结果见表４。由表可知，在酶的添加量为４％时提取率最大，为６９．０７％，但随着酶的添加量的继续增大，提取率开始出现下降。所以，酶的添加量选４％。

２．１．３酶提温度对沙枣多糖提取率的影响各种酶的活性都有合适的温度范围，温度过高或过低都會降低酶的催化效率，即降低酶促反应速度。温度太高，酶会被破坏，酶的催化作用完全丧失。称取沙枣粉０．５０ ｇ，加去离子水１０ ｍＬ，摇匀，８０ ℃恒温３０ ｍｉｎ，冷却至室温，再准确移取ｐＨ值为３．８１的缓冲溶液配制的质量分数为４％的果胶酶５．００ ｍＬ，酶提温度分别为４０、５０、６０、７０ ℃，酶提时间为２ ｈ，按1.２．３方法操作，研究不同酶提温度对沙枣多糖提取率的影响，结果见表５。由表5可知，随着酶提温度上升，酶的活性也在上升，提取率也随之增大。在６０ ℃时出现最大值，说明此时酶达到最大活性，多糖提取率最大，达６２．９１％。随着酶提温度的继续升高，酶的活性开始下降，提取率也随之减小。所以酶提温度选６０ ℃。

２．１．４酶提时间对沙枣多糖提取率的影响酶作用的时间和酶所反应的程度有密切的关系，如果反应的时间太短，则酶作用的不充分，而当酶作用的程度达到一定值时，提取率也不会随着酶提时间的延长而增大。称取沙枣粉０．５０ ｇ，加去离子水１０ ｍＬ，摇匀，８０ ℃恒温３０ ｍｉｎ，冷却至室温，再准确移取ｐＨ值为３．８１的缓冲溶液配制的质量分数为４％的果胶酶５．００ ｍＬ，酶提温度为６０ ℃，酶提时间分别为１、２、３、４ ｈ，按1.２．３方法操作，研究不同酶提时间对沙枣多糖提取率的影响，结果见表６。由表6可知，在酶提时间为３ ｈ时，提取率为６３．０９％，达最大。而后随着酶提时间增长，提取率开始下降。所以酶提时间选３ ｈ。

２．２正交试验设计及结果

在单因素试验的基础上，以沙枣多糖提取率为指标，选择ｐＨ值、酶的添加量、酶提时间３个因素，每个因素选取３个水平，采用Ｌ９（３４）正交试验优选沙枣多糖的酶提工艺。工艺的因素与水平见表７。

根据表７的因素水平表，进行Ｌ９（３４）试验，正交试验的顺序采取随机抽签的原则，以体现其随机性。而且为了提高试验的准确性，排除单次试验由于人为失误造成的误差，每个试验号都分别做３次平行试验，试验结果取平均值，结果见表８。

以多糖提取率为考察指标，分析果胶酶提取宁夏沙枣多糖的提取工艺，由表８可见，各因素影响主次顺序为：Ｂ＞Ｄ＞Ａ＞Ｃ，Ｂ因素即酶的添加量为影响宁夏沙枣多糖提取率的主要因素，Ａ因素的水平３最大，Ｂ因素的水平３最大，Ｃ因素的水平２最大，因此，最佳水平组合为Ａ３Ｂ３Ｃ２，即果胶酶提取沙枣多糖的最佳工艺为ｐＨ值４．３８，添加酶的质量分数５％，酶提时间３ ｈ。此条件即为正交试验中的９号试验，提取率达７２．９３％，为各次试验最大值，所以不用进行重复性验证试验。

３结论

试验结果表明，酶的添加量是影响宁夏沙枣多糖提取率的主要因素。果胶酶提取宁夏沙枣多糖的最佳工艺为ｐＨ值４．３８，添加酶的质量分数５％，酶提时间３ ｈ，酶提温度60℃。最佳条件下沙枣多糖的提取率为７２．９３％。

参考文献：

［１］ 王雅，赵萍，王玉丽，等． 野生沙枣果实营养成分研究［Ｊ］． 甘肃农业大学学报，２００６，４１（６）：１３０－１３２．

［２］ 辛艳伟． 沙枣的开发和利用［Ｊ］． 安徽农业科学，２００７，３５（２）：３９９－４００．

［３］ 王青宁，吕兴连，彭韵硕，等． 沙枣多糖ＥＡＰ－２的提取纯化及初步分析［Ｊ］． 食品科学，２００７，２８（１）：４３－４７．

［４］ 廉宜君，李炳奇，刘红，等． 复合酶辅助超声波提取沙枣多糖的工艺研究［Ｊ］． 中国中医药信息杂志，２００９，１６（６）：４７－４９．

［５］ 李小平，陈锦屏． 油枣多糖的酶法提取及其对多糖分子量分布的影响［Ｊ］． 食品科学，２００７，２８（８）：１９１－１９２．