花生多肽对小鼠免疫功能影响的研究

刘丽娜 何东平 张声华 王文亮 杜方岭

(山东省农业科学院农产品研究所1,济南 250100)

(武汉工业学院食品学院2,武汉 430023)

(华中农业大学食品学院3,武汉 430070)

花生多肽对小鼠免疫功能影响的研究

刘丽娜1,2,3何东平2张声华3王文亮1杜方岭1

(山东省农业科学院农产品研究所1,济南 250100)

(武汉工业学院食品学院2,武汉 430023)

(华中农业大学食品学院3,武汉 430070)

本试验旨在探讨花生多肽对正常小鼠生长发育及免疫功能的影响。通过动物试验,测定小鼠体重、脏器及免疫器官质量、迟发性超敏反应、自然杀伤细胞 (NK cell)活性、血清免疫球蛋白 (IgG)含量等理化指标及免疫器官的形态学变化。结果表明,花生多肽能够增加小鼠的体重、脏器质量和脏器指数、免疫器官质量和指数,促进小鼠生长发育。中[200 mg/(kg·d)]、高剂量组[400 mg/(kg·d)]花生多肽能够调节迟发型超敏反应、增强 NK细胞活性及血清 IgG的含量,显著提高机体的免疫功能。小鼠免疫器官病理切片观察结果表明:中、高剂量花生多肽组小鼠脾脏组织淋巴小结生发中心扩张,增加了网状细胞和浆细胞数目,这提示花生多肽有提高机体免疫的作用。

花生多肽 免疫 脏器指数 免疫器官指数 迟发型超敏反应 自然杀伤细胞 免疫球蛋白

花生多肽含有人体所必须的 8种氨基酸,此外谷氨酸的含量相当高,多肽中分子质量低于 1 000 u的组分高达 90.53%[1]。现代营养研究表明:相对分子质量低于 1 000的短肽极易被吸收,具有较强的生物活性和功能特性[2-3]。试验采用 Alcalase蛋白酶水解花生冷榨粕制备的花生多肽,在制备过程中采用了膜过滤和低温干燥等工艺,产品得率 86.79%,水解度 19.61%。对花生多肽的营养及免疫功能进行研究,从花生多肽对小鼠脏器质量、指数及理化性质及形态学变化的影响等方面来探讨花生多肽对小鼠免疫功能的影响,为广泛开发利用花生多肽提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验动物:SPF级健康雄性昆明小鼠,120只,2周龄,体重 (15±2)g,由湖北省疾病预防控制中心提供,许可证号:SCXK(鄂)2008-0005;花生冷榨粕:山东德州宏鑫花生蛋白食品有限公司提供;IgG放免分析药盒:原子高科股份有限公司;NK细胞试剂盒:美国 ADL公司;普通小鼠饲料:湖北省医学科学院实验动物中心;其他试剂均为分析纯。

FS-1型匀浆器:江苏省金坛市晶玻实验仪器厂;2-16K型高速冷冻离心机:美国 Sigma公司;DFM-96型 10管放射免疫γ计数器:安徽合肥众成机电有限公司;Model550多功能酶标仪:日本 Bio-RAD公司。

1.2 试验方法

1.2.1 花生多肽的制备

花生多肽制备工艺流程如下[4]:冷榨花生饼→浸出 (50℃,两次各 3 h)→碱溶 (料液比 1∶10,50℃,2 h,pH 8.5)→离心→上清液→酸沉 (pH 4.5)→离心→沉淀→酶解 (加酶量 75 AU/kg底物,料液比 1∶10,45℃,2.5 h,pH 8.0)→灭酶 (pH 4.0～4.5)→离心→超滤→冷冻干燥→花生多肽。

所得花生多肽为乳白色粉末,可溶性氮质量分数 90.87%,4℃保存备用。

1.2.2 试验动物饲养及给药[5]

动物饲养室温度为 24℃,湿度为 65%～80%。每只小鼠每天 5 g饲料,试验动物预饲 1周后,随机分为 4组:对照组,以 200 mg/(kg·d)花生蛋白灌胃小鼠 (以小鼠耐受度为人体 5倍计算)、花生多肽低、中、高剂量组 ,分别以 100、200、400 mg/(kg·d)花生多肽灌胃小鼠。每组 30只。同天开始灌胃,每天灌胃一次,连续 5周后,进行试验。

普通饲料组成 (以 50 kg饲料计算):玉米20.625 kg,麸皮 17.5 kg,豆粕 8 kg,鱼粉 3.125 kg,食盐 0.125 kg,贝粉 0.75 kg,微量元素 50 g,维生素5 g,锌 2 g。

1.2.3 观察小鼠生长情况及体重的变化

喂养中,观察小鼠活动的能力,并且每 3天称量体重 1次。

1.2.4 花生多肽对小鼠免疫器官质量及免疫器官指数[6-7]

处死小鼠后立即取出脾脏及胸腺,用吸水纸吸去污血,称重,免疫器官指数以免疫器官质量 (mg)与体重 (10 g)之比表示。

1.2.5 小鼠脾脏、胸腺病理切片观察[8]

取出小鼠的脾脏及胸腺后,吸去表面的污血,固定于 10%福尔马林溶液中,HE染色观察。

HE染色方法:石蜡切片,厚度 4μm,裱于干净载玻片上,60℃烤片机上烤片 2 h,二甲苯脱蜡 2次,每次 15 min,依次用无水乙醇,95%乙醇,80%乙醇,蒸馏水处理至透明,苏木素染核胞 5～10 min,10%盐酸酒精分化,自来水冲 15 min(返蓝),树脂胶封片。在光学显微镜下观察。

1.2.6 花生多肽对正常小鼠迟发性超敏反应(DTH)的影响[9-10]

饲养 5周后的 4组小鼠中,每组取出 10只,于小鼠腹部脱毛约 3 cm×3 cm的面积,以 1%DNFB液(以 1∶1丙酮麻油液配制)涂于脱毛区,0.05 mL/只。第二天加强一次。然后继续喂养不同的饲料,5 d后,以 1%DNFB液涂于小鼠右耳 (双面),0.01 mL/只,24 h后,脱臼处死,剪下小鼠的左右耳,用打孔器分别在左右耳相同部位打下直径为 8 mm的圆片,用分析天平称重,右耳质量减去左耳质量为肿胀度。

肿胀度 (mg)=右耳质量 -左耳质量

1.2.7 小鼠血清免疫球蛋白 (IgG)含量的测定[11-13]

饲养 5周后的 4组小鼠中,每组取出 10只,眼球取血,并分离得到血清。

取小鼠血清 20μL,加入缓冲液 1 mL混匀,再取稀释的血样 20μL血清,另加入缓冲液 1 mL混匀,然后按 IgG放免试剂盒具体操作说明进行测定。

1.2.8 NK细胞活性测定[7]

取饲养 5周后的小鼠的脾脏,用 PBS缓冲溶液清洗 2次,除去表面血污,剪刀剪碎,冰浴中匀浆(1 g组织 /5 mL PBS缓冲液),-20℃冻融 2次,破膜;离心 10 min(4℃,5 000 r/min),上清液即为脾脏标本溶液。然后按试剂盒操作说明进行测定。

1.2.9 统计学方法

采用-x ±S表示相关指标,应用 t检验进行统计学处理。

2 结果与讨论

2.1 饲养过程中一般观察和大体解剖观察[14-15]

小鼠在饲养过程中无异常现象,进食、饮水、粪便和活动等情况均正常。动物解剖后,观察各脏器情况,没有病变。

2.2 花生多肽对小鼠体重变化的影响

花生多肽对小鼠体重变化的影响见表 1,花生多肽各剂量组小鼠的体重与对照组相比有不同程度的提高,发生明显变化出现在第 3周的时间。第 3周时,各剂量组小鼠体重明显高于对照组小鼠。随着喂养时间的延长,这种趋势更加明显,并且体重的增加与剂量呈剂量对应关系。

表 1 花生多肽对小鼠体重的影响(-x ±S,n=10)

2.3 花生多肽对小鼠免疫器官质量及免疫器官指数的影响

从表 2中可以看出,花生多肽对小鼠的免疫器官有一定的影响,但是未表现出较显著的差异。一般表现为中剂量的花生多肽小鼠的免疫器官质量及其指数较对照组小鼠的要高。这提示中剂量的花生多肽有较强的增加机体免疫功能的作用。

表 2 花生多肽对小鼠免疫器官及其指数的影响(-x±S,n=10)

2.4 小鼠脾脏、胸腺病理切片观察

2.4.1 脾脏病理切片

对照组、花生多肽低、中、高剂量组小鼠的脾脏病理切片图见图 1。

对照组及各剂量组小鼠脾脏被膜、小梁、红髓、白髓结构清楚,中央动脉、淋巴小结、淋巴索形态清晰,分布较均匀。如图 1 d所示中、高剂量组小鼠脾脏淋巴小结生发中心扩张,细胞核较大,网状细胞明显,数目较多,浆细胞增多,其分泌的抗体也会增加,这提示高剂量组小鼠免疫力会有所增强。低剂量组无明显变化。

图 1 小鼠脾脏病理切片

2.4.2 胸腺病理切片

对照组、花生多肽低、中、高剂量组小鼠的胸腺病理切片图见图 2。

对照组及各剂量组小鼠胸腺小叶、皮质、髓质结构清楚,胸腺细胞,上皮网状细胞、胸腺小体等形态清晰。但如图 2所示高倍镜下观察各剂量组组织结构与对照组相比无明显差异。这说明虽然生化指标发生了变化,免疫力有所增强,但这些变化不足以引起胸腺形态学上的变化。

图 2 小鼠胸腺病理切片

2.5 花生多肽对正常小鼠迟发性超敏反应 (DTH)的影响

从表 3中可知,其中低剂量组[100 mg/(kg·d)]小鼠的迟发性超敏反应肿胀度要显著高于对照组(P<0.05)。添加中剂量组 [200 mg/(kg·d)]小鼠的肿胀度极显著的高于对照组 (P<0.01)。高剂量组[400 mg/(kg·d)]小鼠的肿胀度虽然与对照组相比也具有显著性,但是下降了。这说明一定剂量的花生多肽可以提高正常小鼠的免疫功能。所用的 3个剂量中,中剂量的花生多肽 [200 mg/(kg·d)]是提高正常小鼠免疫功能的最佳剂量。

表 3 花生多肽对正常小鼠迟发性超敏反应的影响(-x±S,n=10)

2.6 花生多肽对正常小鼠 IgG含量的影响

花生多肽对小鼠 IgG含量的影响见表 4,通过放免法测定小鼠血清中 IgG的含量,各花生多肽剂量组小鼠的血清 IgG的含量与对照组相比,其值虽然都没有表现出非常显著的差异,但在一定程度上都有所增加。这说明花生多肽在一定程度上对小鼠的体液免疫有所增强。2.7 花生多肽对小鼠脾脏 NK细胞活性的影响

表 4 花生多肽对正常小鼠 IgG含量的影响(-x±S,n=10)

NK细胞活性的测定结果如见表 5。与对照组相比,各剂量组小鼠 NK细胞活性均有增强。高剂量组[400 mg/(kg·d)]极显著的高于对照组 (P<0.01),呈剂量 -效应关系。

表 5 花生多肽对小鼠NK细胞活性的影响(-x ±S,n=10)

3 讨论与结论

3.1 花生多肽对小鼠体重的影响

随着喂养的时间的延长,花生多肽对小鼠体重的影响越明显。喂养的时间越长,剂量越大,与对照组相比,小鼠体重增加显著。说明花生多肽在一定程度上促进了小鼠的生长。

3.2 花生多肽对小鼠免疫器官和免疫器官指数的影响

花生多肽对小鼠的免疫器官质量和指数有一定的影响,但与对照组相比未表现出较显著的差异。通过观察小鼠脾脏的病理切片,高剂量组[400 mg/(kg·d)]小鼠脾脏淋巴小结生发中心扩张,网状细胞数目较多,浆细胞增多,其分泌的抗体也会增加,这提示花生多肽有增加小鼠免疫功能的作用。

3.3 花生多肽对小鼠免疫功能的影响

迟发型超敏反应和 NK细胞活性是细胞免疫常用的评价指标,两者的测定结果可以反映出药物的免疫调节功能[16-18]。本试验研究结果显示,各剂量组均有提高小鼠迟发型超敏反应及 NK细胞活性的作用,有增强小鼠免疫功能的效果。

血清中 IgG是全身性体液免疫反应的效应因子,是再次体液免疫应答产生的主要免疫球蛋白,在血液中含量最高,在机体防御中发挥抗感染、中和毒素及调理等作用,其含量在一定程度上也反映了对机体体液免疫的调节功能[19-21]。试验表明,花生多肽能够提高小鼠血清中 IgG含量,可以进一步说明:一定剂量的花生多肽可以在一定程度上增强机体的体液免疫能力。

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Effects of Peanut Peptides on I mmune Function ofMice

Liu Lina1,2,3He Dongping2Zhang Shenghua3WangWenliang1Du Fangling1
(Institute ofAgro-Food Science and Technology,Shandong Academy ofAgricultural Sciences1,Jinan 250100)
(College of Food Science and Technology,HuazhongAgriculturalUniversity2,Wuhan 430070)
(College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University3,Wuhan 430023)

This study aims to explore the effect of peanut peptides(PPs)on growth and immune function of mice through animal experiment and observation of the trend of bodyweight and immune organs.Results:PPs accel2 erates the growth and development ofmice to a certain extent.PPs atmiddle dosage[200 mg/(kg·d)]or high dos2 age[400 mg/(kg·d)]have obvious action on promoting the reaction ability of delayed type hypersensitivity(DTH),and raising the levelofNatural Killer cell(NK cell)activity and contentof serum IgG inmice.PPs i mprove the non2 specific and specific immune ability ofmice.From pathological observation of spleen,the number of reticulocyte and plasma cellof spleen in mice fed with PPs atmiddle or high dosage are increased.These imply PPs could improve the immune function ofmice.

peanut peptides(PPs),immunity,viscera index,immune organ index,DTH,NK cell,IgG

TS201.4

A

1003-0174(2011)01-0079-05

公益性行业 (农业)科研专项 (200903043-3-2),农业部科技成果转化项目 (2009C60050),山东省自主创新成果转化重大专项(2009ZHZX1A1303)

2009-12-07

刘丽娜,女,1978年出生,博士,农产品加工

杜方岭,男,1972年出生,研究员,农产品加工