隐匿性HBV感染者血清中HBV S基因变异分析

张玲荣，马 媛，郝彦琴，朱新宇 (山西医科大学第一临床医学院感染病科，太原 030001;通讯作者，E-mail:zxy6608056@163.com)

隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult HBV infection，OBI)是HBV感染的特殊形式，是临床和流行病学的一大难题，影响对HBV的诊断，导致临床漏检及献血员筛检错误，可造成HBV传播，并与肝硬化、肝癌相关。目前隐匿性HBV感染的机制尚不清楚。本文对不明原因的肝病患者血清标本进行巢式PCR扩增，对扩增的HBV S基因进行序列分析，旨在从基因变异角度分析HBV隐匿性感染的分子机制。

1 材料与方法

1.1 病例选择及血清收集 76例均为2010－07～2011－03在山西医科大学第一临床医学院因不明原因肝病住院的患者，其中男性47例，女性29例，年龄32－69岁，平均年龄(48.22 ±16.33)岁;病程1－9年;其中慢性肝炎31例，肝硬化41例，肝癌4例。入选患者包括血清乙肝病毒表面标志物(HBVM)均阴性和单个或者多个抗体阳性者。所有患者排除其他病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病、药物性肝病及代谢性肝病等。收集10例HBV DNA载量为106copy/ml乙肝患者为阳性对照。

清晨空腹采肘静脉血3 ml，3 000 r/min离心10 min，取上清，置于－20℃待检。

1.2 主要试剂与仪器 TaqDNA聚合酶、dNTP购自大连宝生物公司;ELISA试剂购自美国Abbott公司;病毒核酸提取试剂盒购自美国OMEGA公司;Tanon Gis-2010全自动图像处理系统为天能科技(上海)有限公司产品，PTC-100型PCR扩增仪为美国MJ公司产品。

1.3 引物设计与合成 选择HBV基因组中保守的S区。外侧引物:上游引物 5'－CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC－3'，下游引物5'－ATACCCAAAGACAAAAGAAAA－3';内侧引物:上游引物 5'－GCGGGTTTTTCTTGTTGAC－3'，下游引物 5'－GGGACTCAAGATGTTGTACA－3';产物条带为564 bp。

1.4 病毒核酸的提取与扩增 患者及阳性对照血清均采用柱吸附法提取HBV DNA，应用巢式PCR方法扩增nt56－nt767 HBV S区DNA片段，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 基因测序 从血清HBV DNA阳性者中随机抽取8例测序，测序范围为HBV S基因序列nt56－nt767，包括aa决定簇(124－147aa，nt524－nt595)，测序工作由大连宝生物公司完成。

2 结果

不明原因肝病患者血清HBV DNA S区扩增结果见图1，目的条带位于500 bp－700 bp之间。76例不明原因肝病患者中16例血清HBVDNA阳性，阳性率21%。

图1 不明原因肝病患者血清HBV DNA S区巢式PCR反应电泳结果图

8例隐匿性HBV感染者S区“a”蛋白决定簇基因测序结果见图2。8例隐匿性HBV感染者“a”决定簇内推导蛋白序列结果见图3。“a”决定簇外基因突变位点如图4所示。由图2－4可知，S基因的扩增区为nt203－nt767，共564 bp，包括a决定簇(124－147残基)的基因，第122，160位氨基酸分别为赖氨酸和精氨酸，为adr亚型。a决定簇内基因序列比对发现，nt587出现G→A的突变，推导氨基酸由甘氨酸变异为精氨酸，即较为常见的G145R突变。a决定簇外基因序列比对发现，nt355、nt484碱基均由A→C，推导氨基酸无变化，nt512碱基由C→A，推导氨基酸由脯氨酸变异为苏氨酸。

图2 8例隐匿性HBV感染患者S区“a”蛋白决定簇基因测序结果

图3 8例隐匿性HBV感染者“a”决定簇内推导蛋白序列结果

图4 “a”决定簇外基因突变位点

3 讨论

目前在临床上约10%－20%的慢性肝病患者依据临床表现和常规生化及血清学检查仍不能明确病因，其中包括20%肝癌，15%肝硬化［1］。在部分血清HBsAg阴性的个体，应用PCR技术可以检测出血清和肝组织中HBV DNA阳性，称之为隐匿性HBV感染。这种感染可发生于抗HBs和/或抗HBc阳性的患者，也可见于血清 HBVM均阴性的个体［2］。隐匿性HBV感染的机制尚不完全清楚，目前研究认为，HBV低水平复制、抗原表达量低、HBV基因变异、HBV整合到宿主染色体中、外周血单核细胞系感染、宿主免疫应答异常等均可导致隐匿性HBV感染［3，4］。目前关注较多的是病毒基因变异，因病毒基因变异可导致检测结果出现假阴性，亦可导致病毒低水平复制，抗原表达量低，低于检测限或导致病毒颗粒分泌障碍［5］。Nakamoto等［6］对 2 例确诊为非乙非丙型肝炎患者中检测出低水平的HBV，在随访中，用PCR方法扩增出S或X基因，通过测序，发现HBV存在变异，其中1例DR2的5'端发生T→C的突变，另1例还同时存在X区的155 bp缺失。这些病毒分子发生的变异可从不同角度解释发生隐匿性HBV感染的原因。

本实验对8例隐匿性HBV感染者，通过扩增nt56－nt767 HBV S区DNA片段并基因测序，分析可能影响隐匿性HBV感染的分子生物学机制。由于隐匿性HBV感染病毒极低水平复制，病毒载量较低，故采用灵敏度较高的巢式PCR方法。在引物选择上，选择较为保守的S区。S区的变异影响了HBsAg的检出和病毒大颗粒的装载及释放，也会导致病毒的低水平复制。所以，本次测序选择S区，查找变异位点，分析与隐匿性HBV感染的关系。

HBsAg共有9个亚型，拥有一个共同保守的a决定簇，其主要由S区的124－147aa(氨基酸)构成。在空间结构上，由aa124与aa137和aa139与aa147的半胱氨酸经双硫键连接成两个袢状结构，此结构对a决定簇的功能起重要作用。一般认为a决定簇的145位氨基酸突变率发生最高，其次为126、141、122或者123也常发生突变。本组76例不明原因肝病患者中有16例为血清HBV DNA阳性者，阳性率21%。随机选择8例测序，a决定簇内nt587出现G→A的突变，推导氨基酸由甘氨酸变异为精氨酸，即较为常见的G145R突变。a决定簇外基因序列比对发现，nt355、nt484碱基均由A→C，推导氨基酸无变化，nt512碱基由C→A，推导氨基酸由脯氨酸变异为苏氨酸。

综上所述，HBV感染人体是一个复杂的生物学过程，尤其是HBVM全阴性的隐匿性感染，其发生机制复杂，涉及HBV的变异、整合、隐蔽及宿主的免疫缺陷等。本研究发现，G145R突变在隐匿性HBV感染中发生，可导致S基因区变异，这可能是导致HBV隐匿性感染的重要原因之一，有待深入研究。

［1］ Hollinger FB，Sood G.Occult hepatitis B virus infection:a covert operation［J］.J Viral Hepat，2010，17(1):1－15.

［2］ Formijn J，Hans L，Ben B.Occult hepatitis B infection:an evolutionary scenario［J］.Virol J，2008，5(12):146－148.

［3］ Aller de la Fuente R，Gutiérrez ML，Garcia-Samaniego J，et al.Pathogenesis of occult chronic hepatitis B virus infection［J］.World J Gastroenterol，2011，17(12):1543－1548.

［4］ 陈常云，朱新宇.隐匿性乙型肝炎病毒(HBV)感染［J］.中华肝脏病杂志，2005，13(11):873－875.

［5］ Raimondo G，Pollicino T，Cacciola I，et al.Occult hepatitis B virus infection［J］.J Hepatol，2007，46:160－170.

［6］ Nakamoto N，Saito H，Edinuma H，et al.Genomic mutations with amino acid substitutions of circulating hepatitis B virus found in non B，non C patients with hepatocellular carcinoma［J］.Inter Med，2003，42(4):322－330.