quot;黑美人quot;马铃薯多酚氧化酶的特性研究

周向军，高义霞，袁毅君，郑 芳，张 继，2，*

（1.天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001；2.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州730070）

quot;黑美人quot;马铃薯多酚氧化酶的特性研究

周向军1，高义霞1，袁毅君1，郑 芳1，张 继1，2，*

（1.天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001；2.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州730070）

以邻苯二酚为底物，在413nm处测定黑美人马铃薯多酚氧化酶（PPO）的活性，研究了温度、pH、底物浓度对其活性的影响，并建立了酶促褐变反应动力学方程，探讨了L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、EDTA及亚硫酸氢钠五种抑制剂对酶促褐变的抑制效果。结果表明：黑美人马铃薯多酚氧化酶最适反应pH为6.3；最适反应温度为35℃；酶促褐变反应动力学符合米氏方程描述的单底物酶促反应动力学，以邻苯二酚为底物，Km=0.0011mol/L，Vmax=142.23U/min·g；动力学方程为V=142.23［S］/（0.0011+［S］）；五种抑制剂均对PPO酶促褐变具有抑制作用，其强弱依次为亚硫酸氢钠＞L-半胱氨酸＞抗坏血酸＞EDTA＞柠檬酸。

“黑美人”马铃薯，多酚氧化酶，抑制剂，反应动力学，酶促褐变

“黑美人”马铃薯，又称紫色马铃薯，表皮光滑，呈黑紫色，果肉色泽也为紫色。这种马铃薯不但外表好看，其营养价值也比普通马铃薯高，它不但含有普通马铃薯所拥有的淀粉、蛋白质、有机酸，而且富含有花青素、VC、胡萝卜等多种维生素，素有“地下苹果”和“第二面包”之称［1］。黑美人马铃薯薯肉含有大量的花青素，而花青素是一种天然抗氧化剂，可以消除人体内因代谢产生的有害物质-自由基，因此黑美人马铃薯具有抗癌、延缓机体组织衰老、增强血管弹性、改善循环系统、增进皮肤光滑度、抑制炎症和过敏、改善关节的柔韧性等功效［2］。多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，植物受到机械损伤或病菌感染后，PPO催化酚与O2氧化成醌与蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致黑色素的生成［3］，使马铃薯色泽变劣，品质下降，影响其进一步加工，因此研究PPO酶促褐变机理、控制加工过程中的褐变程度对于提高黑美人马铃薯的应用价值具有重要作用。本研究主要对PPO活性的影响因素进行了探索，并分析了几种抗褐变剂的抑制效果，旨在为黑美人马铃薯加工过程防止褐变提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜黑美人马铃薯 采购于甘肃省天水市兰天综合超市；邻苯二酚、L-半胱氨酸、亚硫酸氢钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、L-半胱氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等 均为分析纯。

高速冷冻离心机，分光光度计，数显恒温水浴锅，精密酸度计，电子天平，透析袋（MWCO 14000），磁力搅拌器等。

1.2 实验方法

1.2.1 黑美人马铃薯多酚氧化酶粗酶液的制备 取新鲜黑美人马铃薯去皮，精确称取5g，迅速放入-20℃预冷的研钵中，按照1∶5（W/V）的比例依次加入预冷的磷酸缓冲液（pH6.8）30mL、2%PVPP，研磨3min成匀浆［4］，充分混合，置4℃冰箱中静止30min后，低温搅拌透析24h，期间不断更换外液5次。将袋内液全部转入离心管中，4℃，5000r/min离心15min，倾出上清液密封，4℃保存备用。

1.2.2 PPO活性的测定 以1.95mL、pH6.8的磷酸缓冲液和0.5mL、0.1μmol/L的邻苯二酚溶液为底物，加入0.5mL酶液，35℃反应 5min，于最大吸收波长413nm处测定OD值。酶活力单位定义：在测定条件下，吸光度值每分钟增加0.01所需要的酶量定义为一个活力单位［5］。

1.2.3 温度对酶促反应速度的影响 分别在10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃条件下，测定PPO活性，确定最佳酶促反应温度。

1.2.4 pH对酶促反应速度的影响 取14个试管，分别加入pH为2.8、3.3、3.8、4.3、4.8、5.3、5.8、6.3、6.8、7.3、7.8、8.3、8.8、9.3的磷酸缓冲液进行酶促反应，在35℃下测定吸光值，确定最佳酶促反应pH。

1.2.5 不同底物浓度对酶促反应速度的影响 在35℃，pH6.3条件下测定底物浓度分别为0.0001、0.0002、0.0004、0.0006、0.0008、0.001、0.002、0.004mol/L时的吸光度，得不同底物浓度随时间的变化曲线，并拟合各直线斜率，即为反应初速度。

1.2.6 不同抑制剂对酶促反应速度的影响 各反应体系中分别加入半胱氨酸、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、EDTA及柠檬酸五种不同浓度的抑制剂，同时以相同体积的蒸馏水为对照，测定黑美人马铃薯PPO活性，以对照实验测得的数据为PPO的100%相对活力，计算各抑制剂的抑制百分比。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的选择

黑美人马铃薯PPO以邻苯二酚为底物进行酶促化学反应，生成褐色醌类化合物，进行波长扫描得到吸收曲线，见图1。由图1可知，产物在413nm处具有最大吸收峰。因此，本研究中PPO活性的测定波长均选择413nm。

2.2 黑美人马铃薯多酚氧化酶反应进程曲线

由图2可知，在反应初始阶段，酶促褐变反应发生速度加快，几乎呈线性增加，但当反应时间达5min后，曲线的斜率逐渐降低，说明反应速率下降，究其主要原因可能为：一是底物浓度降低和产物浓度增加致使逆反应加强；二是醌类物质不稳定，黑美人马铃薯PPO酶液中含有抗坏血酸等抗氧化剂，生成的产物被其还原成邻苯二酚［6］。因此选择5min为酶促反应时间。

图1 波长扫描曲线

图2 黑美人马铃薯PPO反应进程曲线

2.3 温度对PPO活性的影响

温度与PPO活性的关系曲线见图3。由图3知，在35℃以下，黑美人马铃薯PPO活性随温度升高而逐渐增加，但活力相对较高且变化不大，说明PPO是一种嗜冷酶［7］；当温度达到35℃以上时，PPO活性逐渐下降，且变化较大，说明黑美人马铃薯PPO对热不稳定，究其原因可能为：温度增高，加速酶促反应速度，但当超过最适温度后，反而使酶失活，降低了酶促反应速度［8］。在35℃时表现出最大吸收值，即黑美人马铃薯PPO最适温度为35℃。

图3 温度对PPO活性的影响

2.4 pH对PPO活性的影响

pH和PPO活性的关系曲线见图4。由图4可知，pH对PPO活性的影响非常灵敏，当 pH处于3.8～6.3时，酶促反应速度明显加快，原因可能是酸性条件下对辅助因子Cu2+的稳定性有利；当pH达到6.8后，酶促反应速度开始急剧下降，原因可能是碱性条件下辅助因子Cu2+解离出来，形成Cu（OH）2沉淀，使酶活性显著降低［9］。在pH3.8、5.3、6.3时，分别具有相应的吸收峰，表明PPO具有三个同工酶［10］。pH6.3处具有最大PPO活性，这是因为其活性中心含有组氨酸基团（pK=6.0），所以在中性条件下表现出较高的PPO活性，因此黑美人马铃薯PPO最适pH为6.3。

2.5 底物浓度对PPO活性的影响

制作不同底物浓度随时间的变化曲线，并分别拟合所得直线斜率，此斜率即为反应初速度，并制作初速度与底物浓度的关系曲线图，如图5、图6所示。

图4 pH对PPO活性的影响

图5 不同底物浓度对反应速度的影响

图6 反应初速度随底物浓度的变化曲线

由图6可以看出，黑美人马铃薯PPO酶促褐变反应初速度随底物浓度的变化曲线类似于米氏方程描述的变化规律。

对实验结果利用双倒数作图进行相应的处理进行验证，得1/V0-1/［S］的关系图，如图7所示，拟合得到的直线相关系数达到0.9933，可见黑美人马铃薯PPO酶促褐变反应动力学符合米氏方程［11］。根据直线斜率和截距可求得该反应的Km=0.001128mol/L，Vmax=142.22816U/min·g，相应的动力学方程为V= 142.23［S］/（0.0011+［S］）（U/min）。

2.6 抑制剂对PPO活性的影响

半胱氨酸、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、EDTA及柠檬酸五种抑制剂对PPO活性的影响见图8和图9。由图8和图9可知，亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、EDTA、柠檬酸均对黑美人马铃薯PPO活性有一定的抑制作用。亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸在较低浓度时具有较好的抑制效果，当达到10mmol/L时，PPO活性几乎被完全抑制；对于EDTA和柠檬酸，当达到200mmol/L时，PPO活性被柠檬酸抑制20%左右，被EDTA完全抑制。亚硫酸氢钠的相对活性出现负值原因可能是过多的亚硫酸氢钠将体系内本身存在的醌类物质还原成无色物质所致［12］。在中性和碱性溶液中，抗坏血酸很不稳定，容易褐变，另外，由于粗酶液体系中本身含有抗坏血酸氧化酶，所以当加入抗坏血酸时，首先抗坏血酸被氧化形成脱氢抗坏血酸，水合形成2，3-二酮古洛糖酸，脱水脱羧形成糠醛和二氧化碳，再进一步形成褐色素，所以当抗坏血酸在低浓度时（4mmol/L以下），主要促进褐变，致使没有抑制效果；浓度增大时（4mmol/L以上），褐变被逐渐抑制。柠檬酸主要是提供酸性环境，使PPO偏离最适pH，同时三个羧基螯合Cu2+；EDTA提供碱性环境，同时也具有螯合金属离子的作用；抗坏血酸、亚硫酸氢钠及半胱氨酸对PPO的抑制作用主要是其还原酚氧化生成的醌类化合物成无色化合物［12］。

图7 1/V0-1/［S］

图8 不同抑制剂对PPO活性的影响

图9 不同抑制剂对PPO活性的影响

3 结论

黑美人马铃薯PPO最适反应pH为6.3；最适反应温度为35℃，为一种嗜冷酶。PPO酶促褐变反应动力学符合米氏方程单底物酶促反应动力学。以邻苯二酚为底物，Km=0.0011mol/L，Vmax=142.23U/min·g；动力学方程为V=142.23［S］/（0.0011+［S］）。不同抑制剂对PPO活性影响程度不同，抑制作用强弱依次为亚硫酸氢钠＞L-半胱氨酸＞抗坏血酸＞EDTA＞柠檬酸。

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Study on characteristics of polyphenoloxidase（PPO）in Heimeiren potato

ZHOU Xiang-jun1，GAO Yi-xia1，YUAN Yi-jun1，ZHENG Fang1，ZHANG Ji1，2，*
（1.College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China；2.Department of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China）

The activity of Heimeiren potato polyphenoloxidase（PPO）was determined by spectrophotometer at 413nm using catechol as substrate.The effects of the temperature，pH，substrate concentration and inhibitors on PPO were studied and the reaction kinetics equation was also established.The results showed that the optimum temperature and pH were 35℃and pH6.3，respectively.The reaction kinetics of enzymatic browning accorded with Michaelis Equation model.The Km，Vmaxand kinetics equation were 0.0011mol/L，142.23U/min·g and V=142.23［S］/（0.0011+［S］）using catechol as substrate，respectively.Five different inhibitors demonstrated different effects on enzymatic browning of PPO and the inhibiting order was as follows：sodium bisulfite＞L-cysteine＞ascorbic acid＞EDTA＞citric acid.

Heimeiren potato；polyphenoloxidase（PPO）；inhibitors；reaction kinetics；enzymatic browning

TS255.3

A

1002-0306（2011）01-0115-04

2010-01-18 *通讯联系人

周向军（1980-），男，讲师，研究方向：生物化学与分子生物学。