天麻对灰树花液体深层发酵的影响

贺宗毅，吴天祥

（贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

天麻对灰树花液体深层发酵的影响

贺宗毅，吴天祥*

（贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

研究中药天麻对灰树花液体深层发酵的影响，应用Minitab15软件设计了Plackett-Burman筛选实验，筛选出葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、天麻浓度、无机盐配比4个显著性影响因素，通过正交实验对其进行优化，结果表明天麻对灰树花液体深层发酵的最佳工艺条件为：葡萄糖质量浓度30g/L，蛋白胨质量浓度5.5g/L，天麻质量浓度7g/L，KH2PO4质量浓度1.5g/L，MgSO4质量浓度0.75g/L。每升发酵液中可得到灰树花胞外多糖为3.91g，与不添加天麻的对照组相比，胞外多糖产量提高了3.4%。

灰树花，天麻，胞外多糖，发酵

灰树花（Polyporus frondosus），又名栗子蘑、栗蘑、千佛菌、贝叶多孔菌、甜瓜板、舞茸等，属于真菌门（Eumycota）、担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、非褶菌目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）、多孔菌属（Polyporus）的一种大型真菌［1］。灰树花是一种富含多糖、维生素、氨基酸、蛋白质、无机盐等有效成分的药、食两用菌［2］。灰树花性平味甘，在药用价值方面可用来治疗小便不利、水肿、脚气、肝硬化、腹水、糖尿病及高血压、肥胖等疾病。近年来的研究表明，灰树花中富含的多糖类物质具有明显的抗诱变、抗衰老、调节免疫［3］、抑制肿瘤［4-5］、抗HIV、保肝护肝等生理活性作用［6-8］。天麻（Rhizoma Gastrodiae）［9］为兰科多年生寄生菌植物，以蜜环菌的菌丝或菌丝分泌物为营养来源。天麻主要产于四川、云南、贵州，其干燥块茎富含天麻素，可以入药，具有平肝、息风、止痉的作用，主治头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫抽搐等症。近几年研究表明，向真菌培养基中添加适量的中药可以促进真菌的生长或提高活性产物的产量［10-11］。本实验利用灰树花向发酵培养基中添加了适量的天麻，以胞外多糖产量和菌丝量为考察指标，并用正交实验优化了灰树花发酵培养基。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灰树花（51616） 购于中国农业微生物菌种保藏管理中心；天麻 购于贵阳市药房；斜面种子培养基 PDA培养基［12］；液体种子培养基 葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%；摇瓶发酵培养基 葡萄糖2%，蛋白胨0.4%，天麻0.5%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%；KH2PO4汕头市金矽化工厂；MgSO4浙江省明矾石精细化工厂；蛋白胨浙江海川化学品有限公司；葡萄糖 汕头市西陇化工厂；无水乙醇 成都金山化学试剂有限公司。

722型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；高速离心机TDL-40B 上海安亭科学仪器厂；净化工作台SW-CJ-1D 苏州净化设备有限公司；数显鼓风干燥箱GZX-9070、生化培养SPX-150B-Z、高压灭菌锅 上海博迅实业有限公司设备厂；电冰箱 合肥荣事达电冰箱有限公司；分析天平AUY120岛津国际贸易公司。

1.2 实验方法

1.2.1 斜面种子培养 于母种试管中切取出黄豆粒大小的菌丝块，接种于斜面中部，25℃恒温培养9d。

1.2.2 液体种子培养 将培养好的斜面菌种切取蚕豆大小，接种于液体培养基中，250mL三角瓶装液量100mL，25℃，150r/min，摇床培养9d。

1.2.3 摇瓶发酵培养 按10%的接种量取液体种子进行接种，250mL三角瓶装液量 100mL，25℃，150r/min，摇床培养8d。

1.2.4 生物量计算 将发酵液离心（4000r/min，20min），用蒸馏水冲洗菌丝滤饼两次，再离心，菌丝在90℃电热恒温干燥箱中烘干至恒重，称重得菌丝生物量。

1.2.5 胞外多糖含量测定 将 100mL发酵液经4000r/min离心20min，得到的滤液用3，5-二硝基水杨酸比色法［13］测还原糖含量、苯酚-硫酸法［14］测总糖含量。胞外多糖含量等于总糖含量与还原糖含量之差。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 碳源的确定 选择葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉分别作为灰树花发酵培养基的碳源，质量浓度为3%，以空白组作为对照，其它条件不变。发酵完成后分别测定菌丝生物量及胞外多糖产量，以考察不同碳源对灰树花生长的影响，实验结果见图1。

图1 不同碳源对灰树花深层发酵的影响

碳源是灰树花能量代谢的来源，不同种类的碳源对其发酵产胞外多糖的影响差异显著，由图1可以得出，灰树花能够比较好地利用麦芽糖和葡萄糖，但是以葡萄糖作为碳源时胞外多糖产量最高，质量浓度为2.21g/L，菌体生物量也最高，故选葡萄糖作为碳源。

2.1.2 氮源的确定 以葡萄糖为碳源，分别选择蛋白胨、尿素、酵母膏、硫酸铵、磷酸二氢铵作为发酵培养基的氮源，质量浓度为0.4%，以空白组作为对照，其它条件不变。发酵完成后分别测定菌丝生物量及胞外多糖产量，考察不同氮源对灰树花生长的影响，实验结果见图2。

氮是灰树花生长过程中不可缺少的元素，研究了上述5种氮源，从图2中可得出，灰树花对有机氮源的利用优于无机氮源（尿素除外），其中又以蛋白胨为最佳，所以选择蛋白胨为氮源。

图2 不同氮源对灰树花深层发酵的影响

2.1.3 碳源质量浓度对菌体生长的影响 在发酵培养基中分别添加不同质量浓度的葡萄糖，其它条件不变，发酵完成后研究其对胞外多糖及菌丝生物量的影响，结果如图3所示。

图3 葡萄糖添加量对灰树花深层发酵的影响

由图3可得出，在一定的葡萄糖浓度范围内，胞外多糖产量和菌体干重随着葡萄糖浓度的增大而增大。当葡萄糖质量浓度为30g/L时，胞外多糖和菌体干重达到最大值；当葡萄糖浓度超过30g/L时，胞外多糖产量和菌体干重都呈下降趋势，故选择葡萄糖质量浓度为30g/L。

2.1.4 氮源质量浓度对菌体生长的影响 向发酵培养基中分别添加不同质量浓度的蛋白胨，其它条件不变，研究其对胞外多糖及菌丝生物量的影响，结果如图4所示。

图4 蛋白胨添加量对灰树花深层发酵的影响

由图4可以看出，随着蛋白胨质量浓度的增加，灰树花生长旺盛，菌体干重及胞外多糖产量增加。当蛋白胨质量浓度为6g/L时，菌体干重达到最大值，此时胞外多糖产量亦达到最大值，当蛋白胨质量浓度超过6g/L时，灰树花菌体干重及胞外多糖产量均趋于平稳，说明6g/L的蛋白胨能够满足灰树花的生长，所以选择蛋白胨质量浓度为6g/L。

2.1.5 无机盐配比对灰树花发酵的影响 药用真菌的生长离不开各种无机离子，其中P、K、Mg等元素为真菌生长所必需。在其它条件不变的情况下，将KH2PO4∶MgSO4按质量比为2∶1的比例添加进行合并考察，结果见图5。

图5 不同无机盐配比对灰树花深层发酵的影响

由图5可知，当KH2PO4和MgSO4的质量浓度分别为2g/L和1g/L时，灰树花发酵最好，此时胞外多糖含量及菌体干重分别为3.12g/L和8.6g/L。

2.1.6 天麻质量浓度对菌体生长的影响 灰树花是药食两用真菌，在摇瓶培养基中加入适量的天麻，利用灰树花强大的分解转化能力，对天麻中的纤维、糖类、蛋白质等物质加以利用。灰树花在生长代谢过程中可以对天麻中的主要成分天麻素进行转化利用，从而提高胞外多糖的产量。在其它条件不变的情况下，不同质量浓度的天麻添加量对灰树花发酵的影响结果见图6。

图6 天麻添加量对灰树花深层发酵的影响

从图6中可以看出，天麻的添加量对灰树花胞外多糖的产生具有一定的促进作用。当天麻质量浓度为7g/L时，胞外多糖产量及菌体干重均达到最大值，但随着天麻质量浓度的升高，灰树花菌体生物量随之降低。可能是天麻中的某些成分对灰树花菌丝的生长产生了抑制作用，所以选择天麻质量浓度为7g/L。

2.1.7 培养时间对灰树花发酵的影响 在实验过程中选择1～11d为发酵周期，在其它条件不变的情况下，考察其对灰树花发酵的影响，结果见图7。

图7 培养时间对灰树花深层发酵的影响

由图7可知，第9d时灰树花产胞外多糖和菌体干重达到最大值，此后随着时间的延长，胞外多糖产量及菌体生物量趋近于平稳，所以选择9d作为发酵培养时间。

2.2 Plackett-Burman筛选实验

根据碳源、氮源浓度、无机盐元素配比、天麻浓度、培养时间的单因素实验结果，设计 n=12的Plackett-Burman筛选实验，每个因子取高（ +1）、低（-1）2个水平，发酵完成后以发酵液中胞外多糖的产量为响应值Y。参数和水平设计见表1，实验结果见表2，各因素的效应评价及系数估计见表3。P＜0.05说明该因素是显著的，可对该因素作进一步的考察。从表3可得，葡萄糖质量浓度、蛋白胨质量浓度、无机盐配比和天麻质量浓度对灰树花深层发酵产胞外多糖具有显著性影响。

表1 Plackett-Burman实验设计参数和水平

表2 Plackett-Burman设计矩阵及结果

表3 Plackett-Burman实验设计结果分析

2.3 正交实验

根据Plackett-Burman筛选实验结果，对葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、天麻浓度及无机盐配比4个因素进行正交实验优化。根据单因素中4个因素的实验结果，取各因素的最优值作为中间水平，进行L9（34）正交实验。各因素选取水平情况见表4，实验结果及分析见表5。

表4 正交实验因素水平表

表5 正交实验设计及结果分析

正交实验结果说明，葡萄糖质量浓度是灰树花深层发酵产胞外多糖的最显著因素，其余三种因素的显著性影响程度依次是蛋白胨、无机盐配比、天麻质量浓度。从表5可知，四因素的最佳组合为：A′1B′2C′1D′2，即葡萄糖质量浓度30g/L，蛋白胨质量浓度5.5g/L，天麻浓度7g/L，KH2PO4质量浓度1.5g/ L，MgSO4质量浓度0.75g/L。按最佳发酵条件，分成A、B两组进行灰树花液体深层发酵，B组为不添加天麻的对照组。9d后测得A组胞外多糖质量浓度平均值为3.91g/L，B组的平均值为3.78g/L。与对照组相比A组胞外多糖产量提高了3.4%。

3 结论

通过在灰树花深层发酵培养基中加入天麻的探索，得出添加天麻可提高灰树花产胞外多糖产量。并通过Plackett-Burman筛选和正交实验，确定了添加天麻后的最佳发酵工艺条件：葡萄糖质量浓度30g/L，蛋白胨质量浓度 5.5g/L，天麻浓度 7g/L，KH2PO4质量浓度1.5g/L，MgSO4质量浓度0.75g/L，培养9d，此时胞外多糖含量可达3.91g/L，与对照组相比胞外多糖产量提高了3.4%。实验表明，添加适量的天麻到灰树花发酵液中可促进其胞外多糖的产生，为今后进一步研究如何提高灰树花产胞外多糖奠定基础。

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Effects of Rhizoma gastrodiae on the submerged fermentation of Polyporus frondosus

HE Zong-yi，WU Tian-xiang*
（School of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

The effects of Rhizoma gastrodiae on Polyporus frondosus in submerged were studied.The concentration of glucose，peptone and Rhizoma gastrodiae，and mineral salt ratio were confirmed as the four important factors by plackett-burman experiment.Then，the four important factors were optimized by orthogonal experiment design.The results showed that under the conditions of glucose 30g/L，peptone 5.5g/L，Rhizoma gastrodiae 7g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO40.75g/L，the yield of exopolysaccharide reached 3.91g/L，the production of exopolysaccharide increased by 3.4%compared with control group.

Polyporus frondosus；Rhizoma Gastrodiae；exopolysaccharide；culture

TS201.1

B

1002-0306（2011）01-0184-04

2010-07-21 *通讯联系人

贺宗毅（1986-），男，硕士研究生，研究方向：应用微生物。

贵州省优秀科技教育人才省长资金项目［黔省专合字（2009）106号］。