竹鼠肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定*

马 磊,颜其贵,2,万 莉,张 琦,杨 映,谢智勇

2.四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室

肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)属于肠杆菌科肠道杆菌属,广泛存在于人和动物肠道、呼吸道以及水、土壤、农产品和林产品中。正常情况下,本菌不会引起动物发病,但是当机体抵抗力下降或本菌大量增殖时,就会引起动物发病甚至暴发性流行[1],肺炎克雷伯氏菌被列为条件致病菌,是目前公认的导致动物和人类发病的克雷伯氏菌[2-3]。其可引起支气管炎、肺炎,泌尿系统和创伤感染,甚至败血症、脑膜炎、腹膜炎[3]等。近年来,虽然中国养殖业,尤其是经济动物养殖业得到了迅猛发展,但由于养殖户的管理水平、养殖场的硬件和软件设施不能进行规范化管理等原因,已经有多起由该菌引起的人畜感染的报道,且已日益被关注[4]。

1 材料与方法

2010年10月四川省某竹鼠人工养殖场竹鼠陆续死亡情况,病情无大小、性别差异。典型症状为突然起病,有寒战和咳嗽,甚至出现意识障碍伴躁动不安等严重症状。剖检后发现腹腔有大量胶胨样积液,肠道严重臌气,肺脏有实变和充血,肝脏肿大,肾脏有出血点。累积剖检濒死病鼠23只。

酵母浸出物、胰蛋白胨等试剂购自Sigma公司;兔血无菌采自健康家兔;药敏试纸(批号：090801)及微量生化反应管(批号：20090714)购自杭州微生物试剂有限公司。2×Taq PCR Master Mix、DNA分子量标准、凝胶回收试剂盒等购自北京天根生化科技有限公司;其余试剂均为国产分析纯。健康昆明小白鼠购于四川大学华西实验动物中心 ,共60只 ,规格 19～21g/只。

引物采用扩增细菌16SrDNA的通用引物[5],上、下游引物序列分别为：5′-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′和 5′-ACGGCTACCT TGTTACGAC T T-3′。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

无菌条件下分别用接种环醮取肝、肺和肠道内部分别接种LB固体和液体培养基、麦康凯培养基,37℃恒温箱培养18～24h,同时进行厌氧培养,对分离到的细菌进行纯化培养,挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检,用5%的兔鲜血平板鉴定溶血性。

将分离纯化的细菌接种于细菌理化特性鉴定用培养基中,进行氧化酶、接触酶、吲哚、糖(醇及苷)类代谢等较系统的理化特性测定,具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[6]。

将分离到的细菌纯化后,参照文献[7]中试验规范进行药敏试验,并对照杭州微生物试剂有限公司的药敏试验判断标准来判定结果。

在培养平板上无菌挑取单个菌落直接加入到反应体系中进行菌落PCR扩增,反应体系(50μ L)：2×Taq PCR Master Mix 20μ L,引物各 1.5μ L,超纯水 27μ L;反应条件：95℃预变性 10min,95℃循环变性30s,53℃退火复性30s,72℃延伸1min30s,进行30个循环,72℃终延伸 8min,最后4℃保存,反应结束后产物经1%琼脂糖凝胶电泳,用琼脂凝胶回收试剂盒将PCR产物回收后,送上海英骏生物技术有限公司测序。

在预试验的基础上,用菌落计数法调整菌悬液浓度至 3.6×109、3.6×108、3.6×107、3.6×106、3.6×105CFU/mL共5个稀释度;采用无菌操作技术,以0.2mL/只的剂量对小白鼠进行腹腔注射,对照组以0.2mL/只的剂量腹腔注射无菌生理盐水,每组5只,健康小白鼠暂养3d观察健康后进行致病性试验;在接种后每隔6h观察一次,连续观察14d,记录实验动物的临床表现,对死亡实验动物进行剖解,观察并记录各组织器官的病变;从死亡小白鼠肺脏和肠道中再次分离细菌,并进行鉴定;依改良寇氏法求出半致死剂量(LD50)[8]。

2 结 果

2.1 细菌分离镜检 剖检的病鼠肺和肠道中均有大量细菌,经分离纯化后获得一株优势菌。该菌株生长的营养要求不高,兼性厌氧,在LB固体培养基形成灰白色黏液状圆形大菌落,用接种环挑之有丝状;麦康凯培养基上长成红色菌落;兔血平板上无溶血现象。革兰氏染色镜检,该菌为短粗、卵圆形G-杆菌,有荚膜,单个或双个存在。

2.2 生化鉴定 该菌为兼性厌氧发酵型无运动能力的G-杆菌,其理化特性见表1。

2.3 药敏试验 表2为药敏试验结果,该菌对供试的头孢美唑等药物高度敏感,对丁胺卡那霉素等药物中度敏感,对洁霉素等药物耐药。

表1 分离菌的生理生化特征Table 1 Biochemical and physiological characteristics of the strain

2.4 分子生物学鉴定结果 将该株菌进行纯化培养后,挑取少量单个菌落进行16SrDNA-PCR扩增(50μ L体系),其产物经1%琼脂凝胶电泳后结果如图1所示,该菌株扩增出的16SrDNA的片断大小约1 500bp。测序后经BLAST分析测序结果表明：该菌株16SrDNA基因部分序列与肺炎克雷伯氏菌(GenBank中的序列注册号：GU339298)的同源性最高,达99%。

2.5 致病性检测 该菌株对小白鼠的致病性结果见表3。发病小白鼠出现呼吸困难、腹腔有胶胨样积液,肠道严重臌气,肺脏有实变和充血,肾脏有出血点等症状,与自然发病竹鼠症状一致;对照组正常。从死亡小鼠肺脏中再次分离到的菌株经鉴定与试验菌株一致。该菌株对小白鼠的LD50为4.5×107CFU/只。

图1 16S rDNA-PCR扩增结果Fig.1 PCR amplif ication of 16S rDNA

3 讨 论

本试验通过对发病竹鼠进行细菌分离,根据培养特性、理化特征和16SrDNA序列分析,判定分离得到的菌株为肺炎克雷伯氏菌。参照相关文献[9-12],选择其敏感实验动物小白鼠对分离菌株进行致病性试验,确定分离得到菌株为此次竹鼠发病的主要病原菌。该菌能引起竹鼠肺炎、腹膜炎和肠道臌气等症状,其 LD50为4.5×107CFU/只。

表2 药敏试验结果Table 2 Drug sensitivity test of the strain

肺炎克雷伯氏菌分布广泛,最先从大叶性肺炎病人的肺组织中分离到,当机体免疫力降低或长期服用抗生素导致菌群失调时易引起感染,若治疗不当则死亡率极高。目前,在人类感染中肺炎克雷伯氏菌是除大肠杆菌外的医源性感染最重要条件致病菌;在动物感染中各种家畜家禽、野生动物及水生动物都可感染[3,13],并且是实验动物质量检测中常被检出的病原菌[14-15],其已成为倍受关注的人兽共患病病原。到目前为止,还没有从竹鼠病变组织中分离到该致病菌的报道。

药敏试验结果表明,此次得到的该株肺炎克雷伯氏菌对头孢美唑等高度敏感,对丁胺卡那霉素等中度敏感,对洁霉素等耐药。建议临床上选用高敏药物或中敏药物加大剂量进行治疗用,避免滥用抗生素而引起的病原菌对大量药物产生耐药性。广谱抗菌素的大量使用导致机体正常菌群的失调,会增加肺炎克雷伯氏菌的易感性,故要慎重用药。据相关资料显示,各种降低免疫功能的慢性病、肾上腺皮质激素和其他免疫抑制剂的应用和某些创伤性诊疗技术也会增加肺炎克雷伯氏菌的易感性,是生产过程中不能忽视的问题。本次试验为竹鼠健康养殖生产和对预防肺炎克雷伯氏菌病提供一定的参考价值。

表3 菌株对小白鼠的致病性(死亡数/试验数)Table 3 Pathogenicity of the strain to mouse(Death no./test no.)

[1]侯相山,王洪水.猪肺炎克雷伯氏菌感染的诊断与防治[J].中国兽医杂志,2007,43(7)：74-74.

[2]Brisse S and Duijkeren E.Identification and antimicrobial susceptibility of 100 Klebsiella animal clinical isolates[J].Veterinary microbiology,2005,105(3-4)：307-312.

[3]贾艳,韩文瑜,杨洋,等.肺炎克雷伯氏菌致病机制研究进展[C].第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会会议论文集,2006：105-108.

[4]高建新,卢兆芸,涂俊凌,等.婴幼儿配方乳粉中检出肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种的报告[J].中国人兽共患病学报,2009,25(006)：611-612.

[5]G reisen K,Loeffelholz M,Purohit A,et al.PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria,including bacteria found in cerebrospinal fluid[J].Journal of clinical microbiology,1994,32(2)：335.

[6]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社,2001：66-92.

[7]倪语星,王金良,徐英春.抗微生物药物敏感性试验规范[S].上海：上海科学技术出版社,2002.

[8]郗宁,韩俭,吴玲.兰州市不同毒力基因型志贺菌致病力研究[J].中国人兽共患病学报,2009,25(003)：273-275.

[9]张成林,陈永林.克雷伯氏菌对大熊猫的致病性探讨[J].中国兽医科技,1997,27(4)：40-41.

[10]彭广能,熊焰.大熊猫肺炎克雷伯氏菌的研究现状[J].四川畜牧兽医,2000,27(B07)：86-87.

[11]周玉龙,李国军,李阳,等.奶牛肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定[J].中国奶牛,2007(6)：36-38.

[12]王印,熊焰,徐志文.梅花鹿肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定[J].中国兽医杂志,2009(4)：70-71.

[13]贾艳,雷连成,何礼洋,等.猪源肺炎克雷伯菌的分离与鉴定[J].吉林农业大学学报,2007,29(2)：196-199.

[14]Matsuda Y.Recent trends in the number of laboratory animals used in Japan[J].Alternatives to laboratory animals,2004,32：299-301.

[15]Pritchett-Corning KR,Cosentino J,Clifford CB.Contemporary prevalence of infectious agents in laboratory mice and rats[J].Laboratory animals,2008,11：l-9.