脱细胞鸡肌腱的制备与体外生物力学测定的实验研究

胡成栋 刘曦 张伯勋 周玉军 陈怀志 李东风 王飞

同种异体肌腱较自体肌腱来源广泛，是目前肌腱替代品的主要来源。常用的冻干肌腱制作保存较方便，但细胞外结构破坏明显，而低温冷冻肌腱操作较为复杂、费时，冷冻过程中形成大量冰晶，致使所保存的肌腱活性较低，同时两者均存在一定程度的免疫排斥反应，而肌腱脱细胞处理在明显降低免疫原性的同时，较好的保留了肌腱的细胞外结构，本文探索同种异体肌腱脱细胞处理的可行性。

1 材料与方法

1．1 设计 以来亨鸡屈趾深肌腱为研究对象，首先应用正交设计法筛选适于进行肌腱脱细胞保存的化学方法，并应用图像分析系统予以判定，随后将脱细胞肌腱进行生物力学测定，并采用单盲法与正常肌腱进行随机对照的验证性研究。所有实验人员均接受过培训。

1．2 材料 3～4个月龄来亨鸡18只，雌雄不拘，体重2．0 kg左右(由解放军总医院实验动物中心提供，普通级)，随机分为2组:以脱细胞处理的鸡屈趾深肌腱为实验组，以新鲜鸡屈趾深肌腱为对照组，每组9只。

1．3 方法

1．3．1 切取标本:来亨鸡俯卧位固定，双下肢外展，常规消毒铺巾，以1%利多卡因进行局部趾神经阻滞，取双侧第1趾掌侧正中切口，长约6 cm，切开皮肤及皮下组织，显露屈趾肌腱鞘，游离并切取屈趾深肌腱，将脱细胞组肌腱置入D-Hank’s液，于－10℃冷冻24 h后备用，新鲜组肌腱于实验前切取应用。

1．3．2 脱细胞肌腱的制备:主要以Courtman等［1］提出的方法为基础完成。①将冻存的左侧第1趾屈肌腱取出，37℃水浴复温，反复冻融3次。②将复温的鸡屈肌腱然后将肌腱置于37℃、5%CO2的环境下，经过0．25%胰蛋白酶 +0．01%EDTA作用12 h。③将胰蛋白酶消化后的肌腱应用D-Hank’s液反复漂洗后，放入1%Triton-X100(D-Hank’s为溶剂)溶液中，在25℃、5%CO2的环境下，水浴振荡(150 r/min)的条件下作用120 h。④再将屈肌腱以无菌蒸馏水持续冲洗48 h。完成了脱细胞肌腱的制备。

1．3．3 脱细胞肌腱形态学观察:分别将新鲜肌腱与脱细胞肌腱，以10%甲醛固定，常规脱水、包埋、切片，苏木素-伊红(HE)染色及Masson三色染色，于光学显微镜下观察。将新鲜肌腱与脱细胞肌腱制成超薄切片，于透射电镜下观察肌腱的超微结构。

1．3．4 羟脯氨酸(Hyp)含量测定:应用碱解比色法［2］，配制标准羟脯氨酸溶液，制备羟脯氨酸标准曲线，然后将2组肌腱(n=6)切成长20 mm腱段，进行体外冷干、称重、研磨、超声破碎、高压水解、加氯氨-T及Ehrlich’s试剂显色、分光光度计检测及计算。

1．3．5 2组肌腱间力学性能比较:将肌腱(n=6)分别固定于生物力学试验机上，进行滞后环、应力松弛试验、破坏试肌腱验测定，并测定的肌腱截面积(将破裂肌腱应用10%甲醛预固定，在破裂肌腱断端邻接处，截取厚约0．5 mm肌腱，于低倍镜下测量肌腱横断面的长轴与横轴，并应用数码相机记录，然后应用Image-Pro Plus 6．0图像分析软件计算横断面的面积)，计算肌腱的残余载荷比(%)、破裂伸长率(%)、弹性模量与破裂强度。

1．4统计学分析应用SPSS 12．0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 大体观察 实验组肌腱为乳白色长索状组织，表面光滑，弹性韧性良好。但对照组肌腱形态稍显松弛。

2．2 光镜观察 实验组可见粗大的胶原纤维沿纵轴平行分布，排列规整，相互间有交叉，可见沿胶原纤维周围呈串珠状纵向分布的肌腱细胞，核呈椭圆形，横切面显示，断面呈网格状，多根胶原纤维连接较紧密呈束状，周围有完整的结缔组织包绕。试验组无肌腱细胞，胶原纤维排列规整，横切面显示胶原纤维周围包绕的结缔组织较疏松，余与对照组基本一致。

2．3 透射电镜观察 对照组肌腱内胶原原纤维排列规整，多呈波浪状，纤维间相互交联，纤维上有明暗交替的周期性横纹，肌腱细胞数量少，分布于胶原原纤维间，肌腱细胞有多个树状突起与胶原原纤维紧密相连，肌腱细胞内胞核为1个，体积较大，核旁可见线粒体和大量粗面内质网，内含絮状物质。实验组内无肌腱细胞，胶原原纤维排列较规整，但较新鲜组松散。

2．4 Hyp含量测定 实验组Hyp含量为(69±6)mg/g，对照组为(68±6)mg/g，2组比较差异无统计学意义(t=0．18，P ＞0．05)。

2．5 肌腱生物力学性能测定

2．5．1 滞后环:2组肌腱均存在滞后环。

2．5．2 应力松弛试验:肌腱临界载荷与峰值载荷的比值为残余载荷比，此比值反映肌腱应力松弛幅度之间的差别。2组间差异无统计学意义(P＞0．05)。见表1。

2．5．3 破坏试验:2组间破裂伸长率差异无统计学意义(P＞0．05)。

2．5．4 2组肌腱力学性能比较:在肌腱的应力-应变曲线的第二段(线区)内，其弹性模量保持基本不变。2组间的弹性模量与破裂强度差异均无统计学意义(P＞0．05)。见表1。

表12组肌腱相关生物力学性能比较n=9，±s

表12组肌腱相关生物力学性能比较n=9，±s

组别 残余载荷比(%)破裂伸长率(%)弹性模量(GPa)破裂强度(MPa)81 ±5 18 ±1．6 1．47 ±0．18 160 ±19 76 ±5 20．0 ±2．2 1．34 ±0．12 172 ±17实验组对照组

3 讨论

对肌腱脱细胞处理的主要目的在于减少免疫原性的同时，较好的保持肌腱基本结构与力学性能，能够为肌腱及髌腱的修复提供移植物，为组织工程化肌腱提供细胞外基质。

3．1 肌腱脱细胞处理的原理 研究发现，同种异体肌腱是一种“结构性”移植，植入的肌腱只起到“生长支架”的作用，肌腱胶原纤维不表达免疫原性，肌腱细胞及抗原呈递细胞 (APC)是产生免疫排斥的主要来源［3－5］。因此，应用化学法对同种异体肌腱进行脱细胞处理后，将有效降低肌腱的免疫原性，同时保留肌腱的胶原纤维结构，为滑膜外肌腱及跟腱、髌腱缺损提供了新的移植材料。

合格的脱细胞肌腱应该达到以下标准:(1)去除异体肌腱的免疫原性;(2)保留肌腱的胶原结构成分;(3)保持肌腱的生物力学特性。常规脱细胞的物质有2种［6，7］:(1)去垢剂:去垢剂是一类可溶于水的脂类，能够裂解脂膜，溶解抗原，清除免疫复合物。去垢剂分为:①离子型:包括SDS、LiDS、胆酸钠、脱氧胆酸钠等。其缺点是使蛋白质高度变性，并使蛋白质以单体形式分离。②非离子型:包括 Triton-X 100、Triton-X 114、NP-40、辛葡糖苷等。对蛋白质的干扰及蛋白质变性的作用较弱。③两性型:包括CHAPS、Zwitterget等。(2)消化酶:应用胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶等作为脱细胞剂。我们根据肌腱组织的结构特点，通过预实验发现联合应用胰蛋白酶、Triton-X 100能够较好的达到实验要求。

3．2 2组肌腱形态结构比较 本实验中，在光镜下观察发现，脱细胞肌腱内无肌腱细胞，而胶原纤维排列稍欠规整，胶原纤维间隙较新鲜组稍宽，出现这种结构的差别的原因，可能在于非离子型去垢剂及消化酶在完成脱细胞过程中，对于胶原结构稍有影响，而这种差别在电镜下较为明显，表现为胶原原纤维间的间隙增宽，排列较紊乱。总之，肌腱经脱细胞处理后，肌腱细胞去除较为彻底，细胞外结构获得较好的保存。

3．3 2组肌腱Hyp测定比较 Hyp是胶原蛋白中的特征性氨基酸，约占胶原总量的10%，主要参与胶原分子间的交联，是胶原分子两股螺旋空间构象的一级结构基础［8］。通过测量肌腱中的Hyp含量可以了解脱细胞处理是否会对肌腱内成分产生影响。本实验应用碱解比色法来测定Hyp结果显示2组肌腱的Hyp含量无统计学意义(P＞0．05)。因此，可以认为脱细胞处理对肌腱的胶原含量无明显影响。

3．4 2组肌腱生物力学性能比较 在本实验中，通过体外单轴纵向拉伸试验，探讨脱细胞处理对肌腱力学性能的影响，结果显示脱细胞肌腱保留了肌腱作为粘弹体的力学特征，存在滞后环和应力松弛现象，2组肌腱间的残余载荷比无统计学意义(P＞0．05)。在破裂实验中，2组肌腱的应力-应变曲线形态基本一致，在曲线的第二段内，应力-应变线性关系明显，其弹性模量差异无统计学意义(P＞0．05)。肌腱的破裂伸长率反映胶原纤维的极限伸展情况，结果显示，2组肌腱破裂伸长率差异无统计学意义(P ＞0．05)。

在软组织的生物力学测试中，软组织截面积的准确测算非常困难，在本实验中，尝试应用了物理测距法、石蜡切片法、冰冻切片法等方法，发现结果误差均较大。最终选择应用10%甲醛预固定，以增加其硬度及脆性，低倍镜下测量截面的长、短径，图像分析软件下测量截面积的方法，获得较为准确的数据，为生物力学计算提供良好的基础。

总之，经过脱细胞处理处理，在去除肌腱细胞的同时，肌腱细胞外胶原结构及力学性能均得以较好保留。

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