早期气道接触细菌抗原对Th1/Th2平衡的影响

冯艳青 刘泉

支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，发病过程涉及淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等多种炎性细胞以及多种细胞因子，发病率呈逐年上升趋势。但其发病机制尚不完全清楚，有研究发现，CD+4T细胞(Th)两种亚型Th1、Th2功能失衡在哮喘发病过程中占据重要地位［1］。为探讨哮喘的免疫学发病机制，本实验设计在大鼠出生早期于鼻咽部给予不同浓度的灭活肺炎链球菌及流感嗜血杆菌混合液，大鼠饲养至成年后造模，检测动物血清中白介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)的水平。

1 材料与方法

1．1 实验动物 健康SD孕鼠4只(北京维通利华实验动物技术有限公司提供);体重240～270 g，8周龄，动物使用许可证号:SCXK(京):2006-0005，所产幼鼠供实验用。

1．2 试剂与仪器 卵蛋白(OVA，Sigma公司);百日咳杆菌菌苗(4．7×1010/ml，北京生物制品研究所);肺炎链球菌［23F型，昌平疾病预防控制中心(CDC)传染病所］;流感嗜血杆菌(乙型，昌平CDC传染病所);超声雾化器(德国百瑞公司);IL-4试剂盒(尚柏生物医学技术有限公司)、IFN-γ试剂盒(尚柏生物医学技术有限公司);自制雾化吸入箱(30 cm×40 cm×50 cm)。

1．3 方法

1．3．1 细菌灭活:将菌种进行传代及培养后，用VITEK比浊仪测定细菌浓度，用终浓度为0．5% ～1%的甲醛溶液灭菌，涂碟确定无活菌后置于－80℃冰箱保存备用。

1．3．2 出生后细菌抗原接种:幼鼠40只，不分雌雄，随机分为5 组:即107、106、105细菌抗原组(A，B，C 组)、哮喘组(D 组)、对照组(E组)，每组8只。细菌抗原组大鼠于出生后第1、3、5、7天分别于鼻咽部给予107、106、105灭活肺炎链球菌及流感嗜血杆菌混合液10 μl，哮喘组和对照组则给予 PBS 10 μl。

1．3．3 哮喘模型制备:大鼠饲养至成年(约6 周龄)，A、B、C、D组大鼠分别于双侧鼠蹊部皮下注射卵蛋白(OVA)(Ggrade V)和氢氧化铝凝胶混悬液共1 ml(含 OVA 1 mg和氢氧化铝50 mg)，同时腹腔注射百日咳杆菌菌苗(5×109/ml)1 ml致敏，2周后，将大鼠置于自制半透明雾化吸入箱中，用2%OVA(GradeⅡ)雾化吸入激发，30 min/次，连续 7 d，30 min/组大鼠则于双侧鼠蹊部皮下注射氢氧化铝凝胶混悬液1氢氧化铝50 mg)，同时腹腔注射0．9%氯化钠溶液1 ml致敏，2周后，使用0．9%氯化钠溶液雾化吸入激发。最后一次激发24 h内采集标本。腹主动脉取血，分离血清，－80℃冰箱保存备用。

1．3．4 血清 IL-4 和 IFN-γ 测定:采用 ELISA 法，IL-4、IFN-γ 的检测按试剂盒说明进行。

1．4统计学分析应用SPSS 17．0统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析方法，组间两两比较方差齐时采用方差分析最小显著法，如方差不齐，则采用近似方差分析Tamhane’s T2方法，P ＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

A、B组大鼠血清中IFN-γ水平与D、E组比较明显下降，差异有统计学意义(P ＜0．05)。见表1。

表15组大鼠血清IL-4和IFN-γ水平比较n=8，±s

表15组大鼠血清IL-4和IFN-γ水平比较n=8，±s

注:与 A 组比较，*P ＜0．01，#P ＜0．01;与 B 组比较，△P ＜0．05，☆P ＜0．01;与 C 组比较，▲P ＜0．05

组别 IL-4(pg/ml) IFN-γ(pg/ml)A组(n=8)26 ±20 11．9 ±2．7 B 组(n=8) 24±4 13．6±4．0 C 组(n=8) 27±11 20．5±4．3 D 组(n=8) 26±9 24．2±8．4＊△E 组(n=8) 20±7 30．6±9．0#☆▲

3 讨论

支气管哮喘是世界范围内的常见病，影响着全球约3亿人的健康［1］，发病率呈逐年上升趋势［2］。关于哮喘发病内在机制的研究发现，CD+4T细胞(Th)两种亚型辅助性T淋巴细胞1(Th1)、辅助性T淋巴细胞2(Th2)功能失衡是哮喘发病的重要机制［3，4］。IFN-γ 和 IL-4分别是 Th1和 Th2细胞的特征性细胞因子，通过检测这两种细胞因子可以了解Th1细胞和Th2细胞的功能状态［5］。骆文玲等［6］给新生SD大鼠皮下注射OVA，大鼠成年后检测其血清中IFN-γ和IL-4，发现哮喘组大鼠血清中IL-4明显高于正常对照组，而IFN-γ则显著下降。李光等［7］给Wistar大鼠腹腔注射OVA，激发后检测哮喘组动物脾单个核细胞培养上清中IL-4水平明显高于正常对照组，而IFN-γ则显著实验结果显示，D组大鼠血清而IFN-γ下降，存在Th2 h1/Th2失衡;早期接触细菌抗原的大鼠，血清IFN-γ水平明显下降，而 IL-4与 D组接近，使 Th1/Th2失衡更为明显［8］。

1 李明华，殷凯生，蔡映云主编．哮喘病学．第2版．北京:人民卫生出版社，2005．33-566．

2 Bonini S．The hygiene hypothesis:epidemiologic evidence．J Pediatr Gastroenterol Nutr，2005，40(suppl 1):37-38．

3 拉杰．哮喘发病机理及Th1/Th2比例的关系．天津医科大学学报，2002，8:403-406．

4 Renz H，Blumer N，Virnas S，et al．The immunological basis of the hygiene hypothesis．Chem Immunol Allergy，2006，91:30-48．

5 Fang SP，Tanaka T，Tago F，et al．Immunomodulatory effects of gyokuheifusan on IFN-gamma/Il-4(Th1/Th2)balance in ovalbumin(OVA)-induced asthma model mice．Biol Pharm Bull，2005，28:829-833．

6 骆文玲，李海潮，郝洪军，等．早期接触过敏原对大鼠哮喘模型的影响．北京大学学报(医学版)，2006，38:159-163．

7 李光，赵育莹，曲书强，等．支气管哮喘模型大鼠IL-4 IL-10 IFN-γ的检测．中国当代儿科杂志，2004，6:474-476．

8 孟文霞，刘艳梅，李晓鸾，等．不同变应对上下气道变应性疾病的影响．河北医药，2010，32:824-825．