体外筛选川芎治疗冠心病的有效成分的提取纯化工艺研究

任 聪，孟宪生，包永瑞

辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600

体外筛选川芎治疗冠心病的有效成分的提取纯化工艺研究

任 聪，孟宪生，包永瑞

辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600

目的：通过体外筛选方法，优选川芎治疗冠心病的有效成分的提取纯化工艺。方法：培养原代乳鼠心肌细胞，利用连二亚硫酸钠（Na2S2O4）缺氧1 h复氧1 h，损伤心肌细胞制备心肌细胞缺氧-复氧损伤模型来模拟体内缺血再灌注损伤，通过体外筛选方法，优选出川芎治疗冠心病的有效成分的最佳提取和纯化工艺。结果：优选出川芎的最佳提取工艺为使用6倍量的水，提取2次，每次1 h；其纯化工艺为使用15 ml HPD-300树脂，取9 BV的0.5 g/ml的川芎提取液上样，以5 BV的50%醇洗脱。结论：通过体外筛选的提取纯化工艺可信度高，为开发研究心脑血管疾病的药物提供了依据。

川芎；提取；纯化；原代乳鼠心肌细胞；冠心病；连二亚硫酸钠

川芎是一种广泛应用于临床来治疗冠心病的常用中药，现代研究表明川芎具有清除氧自由基、钙拮抗、扩血管、抗血小板聚集和血栓形成等多种作用，本文通过原代乳鼠心肌细胞的培养，利用连二亚硫酸钠损伤心肌细胞来模拟体内缺血再灌注损伤，筛选出川芎治疗冠心病的有效成分及其最佳提取和纯化工艺。

1 仪器与试药

1.1 药品和试剂

川芎（购于安国药材批发市场），经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为正品；四甲基偶氮唑酶（美国Difco公司）；胶原酶Ⅰ （美国GIBCO公司）；DMEM高糖和低糖培养液 （美国GIBCO公司出品）；连二亚硫酸钠（天津市化学试剂三厂）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 动物

新生SD乳鼠（1～3 d），由辽宁中医药大学动物室中心提供，达到国家清洁级标准。

1.3 主要仪器

NUAIRETM US AUTOFLOW型CO2培养箱（德国NUAIRE公司）；AE31型倒置荧光相差显微镜 （Motic公司）；UNRISE酶标仪（瑞士TECAN公司）。

2 方法与结果

2.1 川芎提取条件的考察[1-5]

2.1.1 提取溶剂的考察取川芎药材5份，每份25 g，分别加入6倍量的水、30%醇、50%醇、70%醇、90%醇提取，提取1 h，离心，浓缩，定容至50 ml，保存，备用。

2.1.2 正交试验根据预实验及查阅相关文献，选择溶媒量、提取时间、提取次数三个因素，对主要影响因素各取三个水平，进行L9（34）正交试验考察，优选最佳提取条件。见表1。

表1 川芎提取条件的因素和水平表

2.2 川芎纯化条件的考察[5-7]

2.2.1 静态吸附试验取强极性、中极性、弱极性、非极性的HPD-300、HPD-400、NKA-9、AB-8 四种树脂各 1 g，置于 50 ml的锥形瓶中，加入30 ml川芎提取液，每隔20 min振摇10 s，静置24 h，次日过滤，保留树脂，将滤液定容至50 ml容量瓶中，保存，备用。

2.2.2 静态解析试验将过滤后的树脂转移至50 ml的锥形瓶中，加入30 ml 95%醇，不断振摇，过滤至50 ml容量瓶中，保存，备用。

2.3 泄露曲线[5-7]

取HPD-300树脂10 ml上树脂柱，先用95%醇洗，再用大量的水洗至没有醇味，加入0.5 g/ml的川芎提取液，每10 ml接一管，收集洗脱液。床层体积为1、2、3……12 BV。

2.4 动态洗脱[5-7]

2.4.1 洗脱溶媒的考察取HPD-300树脂10 ml上树脂柱，依次用3 BV的水、30%醇、50%醇、70%醇、90%醇洗脱，分别定容至50 ml容量瓶里，保存，备用。

2.4.2 洗脱剂用量的考察取HPD-300树脂10 ml上树脂柱，先用95%醇洗，再用大量的水洗至没有醇味，加入90 ml川芎提取液，用30%乙醇洗脱，每10 ml接一管，收集洗脱液，备用。 床层体积为 1、2、3……8 BV。

2.5 原代乳鼠心肌细胞的培养

2.5.1 原代乳鼠心肌细胞的培养[8-10]取新生SD乳鼠若干只，无菌条件下开胸取心，用PBS液洗净残血。将心室剪成1 mm×1 mm×1 mm碎块，放入培养皿里，加入适量冷PBS，用胰蛋白酶与胶原酶Ⅰ的混合消化液，置37℃水浴中多次消化，收集细胞悬液，以差速贴壁法分离纯化心肌细胞，将心肌细胞悬液静置在培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱里培养60 min，心肌成纤维细胞很快贴壁，吸出细胞悬液，用含10%小牛血清的高糖DMEM培养液调整细胞浓度至5×105～10×105个/ml，转接于96孔板里培养，获得较纯的心肌细胞，在37℃、5%CO2条件下培养，选生长状态佳者于72 h后进行实验。

2.5.2 细胞缺氧复氧损伤模型的制备取已经接种的96孔板，随机分成2组：①缺氧复氧损伤组：加入400 μmol连二亚硫酸钠缺氧1 h，复氧1 h；②给药组：加入各组的溶液。各组均在37℃、5%CO2培养箱里培养24 h。

2.5.3 细胞活力的测定采用MTT法，细胞计数后以105个/孔接种于96孔板中，培养72 h后用于实验，缺氧复氧后每孔加入 20 μl（5 mg/ml）MTT 试剂，37℃、5%的 CO2培养箱继续孵育 4 h，弃上清，加入 150 μl二甲基亚砜（DMSO），室温摇床10 min，酶标仪492 nm波长测定OD值。

以上试验均以缺氧复氧损伤的乳鼠心肌细胞筛选，并以心肌细胞的损伤抑制率作为指标，来评价作用效果的优劣，损伤抑制率=（OD试验-OD损伤）/OD损伤×100%。

2.6 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件，计量资料数据以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析进行组间统计学比较，行t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.7 实验结果

2.7.1 存活心肌细胞确认倒置显微镜下，心肌细胞呈圆形，悬浮。台盼蓝染色计数，未染蓝色为活细胞，显示心肌细胞存活率达96%。4 h后开始逐渐贴壁，初为圆形，后为梭形，细胞在瓶壁逐渐展开，伸出伪足，变为三角形、多边形等不规则的形态。24 h后可见细胞陆续伸出伪足，细胞团最先开始搏动，随后，可见单个细胞开始搏动，搏动频率各异，多在50～120次／min。48 h后大部分细胞都伸出伪足，形成不规则的星形，同步搏动频率为60～90次/min。

2.7.2 提取溶媒的结果结果显示，以水作为提取溶媒时，损伤抑制率最大，说明水是最佳提取溶媒。见表2。

表2 提取溶媒对损伤抑制率的影响

2.7.3 正交试验的结果结果显示，正交4组的损伤抑制率最大，可作为最佳的提取条件。见表3、4、5。

表3 各正交试验组对损伤抑制率的影响

2.7.4 静态吸附的结果结果显示，选用HPD-300效果最佳。见表6。

表4 正交试验方案设计直观分析表

表5 方差分析表

表6 静态吸附对损伤抑制率的影响

2.7.5 静态解析的结果结果显示，选用HPD-300最佳。见表7。

表7 静态解析对损伤抑制率的影响

2.7.6 泄露曲线的结果结果显示，9 BV为最佳的上样量。见表8。

2.7.7 动态解析洗脱溶媒考察的结果结果显示，50%醇为最佳的洗脱溶媒。见表9。

2.7.8 动态解析洗脱溶媒的考察的结果结果显示，5BV为最佳的洗脱溶媒量。见表10。

综上可知，根据以上静态和动态实验，采用体外筛选方法，各组的OD值与损伤组OD值比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；通过比较损伤抑制率，筛选出的川芎治疗冠心病的有效成分的最佳提取工艺为6倍量的水，提取2次，提取1 h；纯化工艺为15 ml的HPD-300树脂，9 BV的0.5 g/ml的药液，以5 BV的50%醇洗脱，纯化收率达到最大值。

表8 泄露曲线中上样量对损伤抑制率的影响

表9 动态解析洗脱溶媒对损伤抑制率的影响

表10 动态解析洗脱溶媒对损伤抑制率的影响

3 讨论

原代乳鼠心肌细胞的培养应注意的问题包括：①取材应该尽量取出生1～3 d的大鼠，出生时间过长的大鼠，心肌的活性不好，很大程度上影响了心肌的生长；②消化液的选择：胰蛋白酶的消化能力很强，但很容易损伤心肌细胞，本文选择胶原酶Ⅰ和胰蛋白酶的混合液，既可以将心肌细胞最大程度的消化，又不会对心肌细胞造成损伤；③差数贴壁：利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，将二者分离，使心肌细胞的纯度能达到90%以上。

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是指心肌缺血后再灌注期间导致的心肌细胞损害，川芎中的阿魏酸为治疗冠心病的主要成分，阿魏酸能抗血小板聚集，抑制血小板5-羟色胺释放，抑制血小板血栓素A2（TXA2）的生成，能降低心肌缺血量和耗氧量，在临床上被用于治疗冠心病、心绞痛，而且其水溶性较好，因此本试验选择水做为提取溶剂，结合正交试验结果，通过体外培养的心肌细胞筛选出了川芎治疗冠心病的有效成分最佳的提取工艺。

川芎所含化学成分复杂，含有阿魏酸、挥发油、多糖等十几类成分，而其主要有效成分阿魏酸含量较低，故阿魏酸的富集、精制、纯化存在一定的难度。本文采用大孔吸附树脂吸附法富集与纯化阿魏酸，从吸附和解吸方面分析，结果显示，心肌细胞的损伤抑制率明显提高，说明大孔树脂吸附法基本适宜于川芎中阿魏酸的分离、富集与纯化。而且HPD-300型大孔树脂具有吸附快、解吸率高、吸附容量大、洗脱率高、再生简便等特点，在分离、富集、纯化中药材主要成分方面有一定的推广价值，也是克服中药新药开发研究中制备工艺水平低的难题可尝试的技术。

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The research of extraction and purification process of active ingredients of Chuanxiong which could treat coronary heart disease through screening methods in vitro

REN Cong,MENG Xiansheng,BAO Yongrui
College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Dalian 116600,China

Objective:To select the best extraction and purification process of active ingredients of Chuanxiong which could treat the coronary heart disease through screening methods in vitro.Methods:Primary cultured neonatal rat cardiomyocytes and sodium hydrosulfite (Na2S2O4)were used for hypoxia 1 h and reoxygenation 1 h to form the cardiomyocyte hypoxia-reoxygenation injury model to simulated in vivo ischemia-reperfusion injury.Screening methods in vitro were used to select the best extraction and purification process of active ingredients of Chuanxiong which could treat coronary heart disease.Results:The best extraction process selected was that,Chuanxiong was extracted for 2 times,1 h for each time with 6 times the amount of water;while the purification process was that,15 ml HPD-300 resin was used,9 BV of 0.5 g/ml of the Chuanxiong extract and 5 BV of 50%ethanol was applied to elute.Conclusions:The technology of extraction and purification through screening methods in vitro has high reliability,and provides a basis for the development of new drug that treat cardiovascular disease.

Chuanxiong;Extraction;Purification;Primary neonatal rat cardiomyocytes;Coronary heart disease;Sodium hydrosulfite

R284.2

A

1673-7210（2011）12（b）-081-04

“十一五”重大新药创制科技重大专项（项目编号：2010ZX09401-304-515）。

任聪（1985.12-），女，汉族，硕士研究生；研究方向：药物分析。

孟宪生（1964.04-），男，汉族，副教授；研究方向：中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析。

2011-07-25）