高压二氧化碳对西瓜汁中过氧化物酶钝化动力学的研究

刘 野，张 超，许 勇，李 武，赵晓燕，*

(1.北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京100097; 2.北京工商大学化学与环境工程学院，北京100048)

高压二氧化碳对西瓜汁中过氧化物酶钝化动力学的研究

刘 野1，2，张 超1，许 勇1，李 武1，赵晓燕1，*

(1.北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京100097; 2.北京工商大学化学与环境工程学院，北京100048)

为了延长西瓜汁的货架期，研究高压二氧化碳处理对西瓜汁中过氧化物酶(peroxidase，POD)的钝化效果。研究以热处理为对照，比较不同高压二氧化碳处理温度和压强对其POD活性残存率的影响。采用二段式模型模拟POD的钝化效果(R2＞0.975)，证明西瓜汁中POD存在敏感型和稳定型两部分。通过动力学分析考察两种类型POD对温度和压强的敏感性，确认高压二氧化碳处理温度、压力、时间、pH和CO2等因素共同导致了POD活性的降低。高压二氧化碳处理比热处理可以更加有效钝化西瓜汁中POD，有助于延长西瓜汁的货架期。

高压二氧化碳，西瓜汁，过氧化物酶，动力学分析

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

京玲无籽西瓜(Citrullus lanatus) 种植于北京市农林科学院蔬菜研究中心延庆农场，西瓜经过清洗、去皮，果肉用打浆机打浆，匀浆经过滤得西瓜汁;聚乙烯聚吡咯烷酮 上海Sigma-Aldrich公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、过氧化氢、无水乙醇 北京化工厂;愈创木酚 国药集团化学试剂有限公司。

天平 瑞士梅特勒-托利多公司;868型pH计美国奥利龙;打浆机 中国珠海飞利浦公司;电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司;3-18 SARTORIUS高速离心机 德国赛多利斯;UV-3802紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;高压二氧化碳杀菌机 中国农业大学研制，型号CAU-HPCD-1，专利号:ZL200520132590.X。

1.2 实验方法

1.2.1 西瓜汁的热处理 量取5mL西瓜汁置于10mL塑料离心管中，放置于30、40、50℃水浴中加热，处理时间分别为2.5、5、10、20、30min，处理后迅速置于冰水浴中冷却。

1.2.2 西瓜汁的HPCD处理 HPCD处理釜预热到设定温度，量取5mL西瓜汁置于10mL塑料离心管中，将烧杯置于HPCD处理釜中。在30MPa下，设定30、40、50℃，每个温度下处理时间分别为2.5、5、10、20、30min。在50℃下，设定8、15、22、30MPa，每个压力下处理时间分别为2.5、5、10、20、30min。处理后迅速从处理釜中取出放入冰水浴冷却。

1.2.3 POD活性测定 POD活性测定参考Fricks等的方法稍作修改［8］。POD粗酶液的提取:10mL西瓜汁加入1%聚乙烯聚吡咯烷酮，在4℃、10000×g条件下离心20min，取上清液进行酶活性测定。POD的反应体系:2.7mL 200mmol/L pH6.0磷酸缓冲液，0.05mL 0.5%的过氧化氢，0.2mL 2%的愈创木酚和0.05mL粗酶液，加酶液后自动反应3min。470nm波长下测定OD值，每隔30s记录一次读数。每毫升西瓜汁每分钟吸光值变化0.001个单位定义为一个酶活力单位。

1.2.4 动力学分析 西瓜汁中POD活性的钝化分析采用两段式模型分析［9］。此模型假设样品中存在两类同工酶，即稳定型和敏感型:

式中:AL和AS分别为敏感型和稳定型酶活性在总酶活中占的比例;kL和kS分别为敏感型和稳定型酶活性的钝化速率(min-1)。

D是指数递减时间(min)，即在设定的温度下，酶活性降低90%所需要的时间。

ZP和ZT表示D值对压强和温度的敏感性，即D值变化一个对数时对应的压强或者温度的变化;P1和P2表示D1和D2对应的压强。

压强和温度对酶钝化反应的影响分别用Eyring公式和Arrhenius公式分析［5，10］。活化体积Va(cm3/ mol)和活化能Ea(kJ/mol)表示压强和温度对反应常数k的影响;P1和P2、T1和T2表示对应k1和k2的压强和绝对温度;R是气体常数，其值为8.314。

1.2.5 统计分析 采用SAS8.12进行因子方差分析及Ducan’s多重检验(P＜0.05)。实验均做三次重复，以均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 处理时间对西瓜汁中POD活性的影响

从表1可以看出，30℃热处理30min内不会降低POD的活性。而40℃和50℃热处理中，POD的活性总体上均呈现下降的趋势，并且处理30min后活性分别下降了11.70%和17.08%。而在30MPa HPCD处理(图1)的几个温度条件下，从0～2.5min，POD的活性迅速下降;而从2.5～30min，POD的活性下降缓慢。同样，在50℃HPCD处理(图2)的几个压强条件下，从0～2.5min，POD的活性急剧下降;而2.5～30min，POD的活性下降则较为缓慢。这种先快后慢的下降方式前人曾有报道。陈玮等报道，胡萝卜中POD在经过25～45℃、15min热处理后其活性急剧下降，而后下降的速度变缓［11］。而Liu等研究则发现，甜菜粗提液中POD活性经35℃热处理不会发生变化，经55℃热处理则随时间延长呈线性下降的趋势，到60min时下降了21.7%;而其在HPCD处理中也随着时间的延长呈线性下降趋势［7］。

表1 常压热处理对西瓜汁中POD残存活性的影响

2.2 处理温度对西瓜汁中POD活性的影响

在西瓜汁的热处理(表1)过程中，除处理时间为10min外，其他处理时间POD的活性总体上都随着温度的升高而呈下降趋势。而在30MPa的HPCD处理(图1)过程中，与30℃下的POD活性相比，40℃下的酶活性只有在处理时间为30min时显著降低;而50℃条件下各处理时间点的POD活性与40℃相比均显著降低。说明在有压强存在的条件下，西瓜中POD对较低温度(30～40℃)下的温度变化不敏感，而随着温度的升高(40～50℃)其敏感度会增加。

2.3 处理压力对西瓜汁中POD活性的影响

如图2所示，同一处理时间的POD残存活性随着压强的增大而显著降低(除20min和30min时8MPa和15MPa下的活性)。在50℃、30min时，8、15、 22、30MPa下的残存酶活依次为77.35%、73.68%、51.78%和42.19%，显著低于同一温度和处理时间热处理的残存酶活(82.92%)。因此，随着压强的增大，POD对温度的敏感性越来越高。并且，HPCD处理对西瓜汁中POD的钝化效果明显好于热处理。

表2 两段式模型拟合HPCD处理对西瓜汁中POD钝化的动力学参数

图1 30MPa不同温度HPCD处理对西瓜汁中POD活性的影响

图2 50℃不同压力HPCD处理对西瓜汁中POD活性的影响

2.4 西瓜汁中POD钝化动力学分析

由于30℃热处理过程中，西瓜汁中POD的活性不发生变化，因此不能用动力学模型进行拟合。尽管40℃和50℃热处理对POD的钝化均符合一级动力学模型，但仍然不能计算出相应的动力学参数。所以无法与HPCD处理的动力学参数进行对比。因此，在这里只做HPCD对西瓜汁中POD钝化的动力学分析。用式(3)对HPCD处理后西瓜中POD的残存活性进行拟合，得到R2均大于0.975，因此HPCD处理对POD活性的影响符合两段式模型。该模型认为在西瓜汁中的POD存在敏感型和稳定型两部分，从而引起两段式的钝化。陈玮等的报道与我们的研究结果相似，认为胡萝卜中的POD热钝化呈两段形式［11］。曾庆梅等研究表明，砀山梨汁中 POD在50℃、400MPa超高压处理过程中，从0～34min其活性下降速度呈现先快后慢的趋势［12］。而另外一些研究认为POD的钝化都符合一级反应动力学，例如甜菜［7］、甜玉米［13］和番茄汁［14］中的 POD。这种差异是由于不同来源的POD具有不同的性质造成的。

如表2所示，AL和AS分别为西瓜汁POD敏感部分和稳定部分所占比例。随着温度和压强的升高，AL逐渐增大，AS逐渐减小，说明温度和压强的升高可以促使POD的稳定部分向敏感部分转化。而西瓜汁中POD钝化的反应速率常数和指数递减时间分别表示为kL，DL(敏感部分)和kS，DS(稳定部分)。并且，同一温度和压强下的DL远小于DS，说明敏感型POD的钝化速率要远高于稳定型。另外，在同一压强下，DL和DS值均随着温度的升高而逐渐降低。同样，在同一温度下，两者也都随着压强的增大而逐渐减小。说明在HPCD处理中温度和压强的共同作用导致西瓜汁中POD活性的降低。通常认为，在同样的处理条件下，Ea和Va值越高表示反应对温度和压强的依赖性越大。在表3中，ZT，S(=66.67℃)低于ZT，L(=86.95℃)，而ZP，S(=37.04MPa)高于ZP，L(= 34.48MPa)，说明稳定型POD对温度的敏感性高于敏感型POD，而对压强的敏感性低于敏感型POD。另外，Ea，S(=28.57kJ/mol)高于Ea，L(=21.86 kJ/mol)，而Va，S的绝对值(=165.91cm3/mol)低于Va，L的绝对值(=178.85cm3/mol)，说明POD稳定部分的钝化对温度的依赖性高于敏感型POD，而对压强的依赖性低于敏感型POD。这与Zhi等关于HPCD钝化苹果果胶甲基酯酶(PME)的研究结果类似，该研究表明稳定型PME比敏感型PME具有更低的ZT值和更高的Ea值［15］。并且Wicker等报道用热处理钝化橙汁中PME时，敏感部分的ZT值也高于稳定部分［16］。

表3 两段式模型拟合HPCD处理对西瓜汁中POD钝化的动力学参数

2.5 西瓜汁中POD钝化机理的探讨

通常认为对酶进行热钝化的机理是加热使原本卷曲成一定构象的酶蛋白伸展开，从而使酶活性中心被破坏而导致失活。而HPCD处理对酶的钝化机理则比较复杂，比如一些功能基团和起到关键作用的金属离子发生脱落可以导致酶的活性丧失。另外，pH是对酶活性有重要影响的一个因素。Denès等报道，当pH从7.5调到4.0时，金冠苹果中的果胶甲基酯酶活性仅存1%［18］。同时酶蛋白中的一些氨基酸可以与CO2结合生成复合物，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶的催化效率降低［19］。并且HPCD处理可以改变酶的二级和三级结构，这也是HPCD处理后酶活性变化的原因［20-21］。所以，HPCD处理对西瓜汁中POD的钝化是温度、压力、处理时间、pH、CO2等一系列因素综合作用的结果。

3 结论与讨论

3.1 热处理30℃条件下，与对照相比，POD活性不发生变化;而40℃和50℃条件下，其活性随着处理时间的延长而呈现一定程度的下降。并且，在同一处理时间下，POD的活性也随着温度的升高而显著降低。在50℃、30min其钝化率为17.08%。从节约能源的角度考虑，工业生产中可以采用50℃、2.5min的处理条件即可以钝化西瓜汁中的大部分POD活性。

3.2 在HPCD处理中，POD的活性的下降随时间呈现先急后缓的趋势;并且随着温度的升高和压强的增大而显著降低。在30MPa、50℃、30min其钝化率为57.81%。用两段式模型可以对POD的降低趋势进行很好的拟合，说明西瓜汁中POD存在敏感型和稳定型两部分。敏感型POD的钝化速率约高于稳定型两个数量级以上。并且与稳定型相比，敏感型对温度的敏感性较低，对压力的敏感性较高。

3.3 HPCD处理对POD的钝化是温度、压力、时间、pH和CO2等因素共同作用的结果。虽然HPCD对西瓜汁中POD具有较好的钝化效果，但其钝化机理及其对酶结构的影响仍有待进一步的研究。

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Inactivation of peroxidase in watermelon juice by high pressure carbon dioxide

LIU Ye1，2，ZHANG Chao1，XU Yong1，LI Wu1，ZHAO Xiao-yan1，*
(1.Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China; 2.School of Chemical and Environmental Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

The effect of high pressure carbon dioxide(HPCD)on peroxidase(POD)activity in watermelon juice was evaluated to extent its shelf-life with the thermal treatments as a control.The experimental plots were well fit by the two-fraction model(R2＞0.975)，suggested that the POD in the watermelon juice included labile and stable fractions.The two fractions had the different sensitivity to the temperature and pressure by the kinetics analysis. Moreover，it was concluded that the combined effects of temperature，pressure，treatment time，pH，and CO2were suggested as the cause of POD inactivation.Consequently，HPCD treatment showed a great capacity to inactive POD of watermelon juice than the thermal treatment，being an option to extend its shelf-life.

high pressure carbon dioxide;watermelon juice;peroxidase;kinetics analysis

TS255.44

A

1002-0306(2011)07-0160-04

在西瓜的加工产品中，西瓜汁越来越受到消费者欢迎，其消费量快速增长［1］。但由于西瓜汁中过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性很高，会导致西瓜汁在贮藏过程中发生颜色和风味的变化［2］。而西瓜又属于热敏性水果，传统的热加工会使西瓜汁产生“煮熟味”，并且会使西瓜汁中的呈色物质聚集形成沉淀，严重影响西瓜的感官品质［3］。所以，传统热处理手段不适于西瓜汁的加工。高压二氧化碳(High Pressure Carbon Dioxide，HPCD)是一种新型的非热技术，在食品加工中有着越来越广泛的应用。该技术可以在较低的温度下钝化酶活性和杀灭微生物，有效保持食品的营养成分和感官品质［4］。而且，二氧化碳很易从食品体系中排出，不会产生食品安全的隐患。因此，利用HPCD处理钝化食品体系酶活性的研究越来越多。Balaban等研究证明HPCD可以有效钝化橙汁中的果胶酯酶［5］。Gui等发现HPCD处理可以将苹果汁中的多酚氧化酶活性钝化至60%以上(55℃、30MPa处理60min)［6］。Liu等发现HPCD处理可以将甜菜粗提液中过氧化物酶活性钝化至86%(55℃、37.5MPa处理60min)［7］。但是，HPCD处理在西瓜汁加工中的应用至今还未见报道。本文通过动力学分析考察了HPCD处理中温度、压强和处理时间对西瓜汁中POD活性的影响，并通过动力学分析探讨其钝化机理。

2010-06-10 *通讯联系人

刘野(1981-)，男，博士研究生，主要从事食品非热加工技术方面的研究。