重金属铅和汞对蚕豆根尖细胞的微核效应

孔令芳，朱红琼，杨晓霞

（大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003）

重金属铅和汞对蚕豆根尖细胞的微核效应

孔令芳，朱红琼，杨晓霞*

（大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003）

以蚕豆根尖为试材，不同浓度的醋酸铅和氯化汞为受检物，探讨重金属Pb2+和Hg2+对蚕豆根尖细胞的微核效应。结果表明：Pb2+和Hg2+均能诱发蚕豆较高的微核率，且微核率随溶液浓度升高而增加，但当高于一定浓度后，微核率反而有下降的趋势。因此，蚕豆可以作为快速检测环境中Pb2+和Hg2+遗传毒性的材料。

铅离子；汞离子；蚕豆根尖细胞；微核千分率

微核试验是以动植物为材料，利用细胞生物学方法通过对其微核率的观察来表示动植物受遗传损伤程度的一种方法〔1〕。微核的形成是细胞受诱变剂作用后的一种遗传学终点〔1-2〕。

蚕豆根尖细胞微核试验（micronucleustest, MC-NT）技术是一种以染色体断裂及纺锤丝损伤为测试终点的植物微核检测方法〔3〕。自Degrassi〔1〕等首先利用蚕豆根尖微核试验建立了诱变剂对蚕豆根尖微核监测系统以来，该技术深受人们重视。此技术作为一项生物监测技术已被广泛应用于水体、土壤和空气等环境污染的监测，并于1986年被列入国家生物监测技术规范（水环境部分），用于监测水体污染〔1，4-10〕。

铅和汞是众多重金属中常见的两种，其中汞是最具危险性的有毒有害元素之一。其主要污染源是工业用铅和汞的散失、燃煤中铅和汞的排放、垃圾焚烧和汽车尾气排放等〔11-12〕。排入生态系统的污染物会引起生物细胞内遗传物质的改变，影响细胞正常的生理、生化等代谢活动的有序进行〔12〕。

本试验拟通过对蚕豆根尖细胞分裂后微核数量的计算，监测铅和汞对环境的污染程度，即验证微核测定技术及其作为一种环境致突变性的检测手段的广泛应用性。

1 材料与方法

供试植物材料为云南大理市售蚕豆。用蒸馏水将分析纯醋酸铅配制成0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、500.0 mg/L、分析纯氯化汞配制成0.01、0.05、0.10、1.00、3.00、6.00 mg/L各6种不同质量浓度的溶液，蒸馏水做阴性对照。

1.1 蚕豆浸种、催芽 选取籽粒饱满、大小一致的蚕豆种子洗净后，放入盛有蒸馏水的大烧杯内，浸泡约24 h，期间换水1～2次。待种子充分吸胀后，将其放入铺有一薄层湿润脱脂棉的解剖盘中，置于（25±1）℃的恒温培养室中培养2～3 d，期间换水4～6次，使其长出1.5～3.0 cm长的初生根。

1.2 染毒处理 选取发育良好、根长基本一致的蚕豆种子，每13～16粒一组（随机组合），放入盛有不同质量浓度的Pb2+和Hg2+溶液的大培养皿中直接染毒，被测液浸没根尖即可。染毒处理24 h，同时选用蒸馏水作阴性对照。

1.3 修复培养 将处理过的种子用蒸馏水浸洗2次，每次5～10 min后，再放入新铺好的湿润脱脂棉的解剖盘（或培养皿）内，按前述培养条件使根尖细胞修复培养22～24 h。

1.4 材料固定 取修复培养后不同处理组的种子，从根尖顶端用剪刀剪下幼根1㎝左右，立即用卡诺氏固定液（3份无水乙醇加1份冰醋酸）固定24 h。将固定后的根尖换入70%乙醇溶液，置于4℃的冰箱中保存备用。

1.5 解离 用蒸馏水清洗固定好的幼根1～2次，每次3～5 min后吸净蒸馏水，用1 mol/L的盐酸在50℃恒温水浴中解离5～20 min，至幼根软化即可。

1.6 染色和制片 将解离后的根尖吸去盐酸，用蒸馏水漂洗数次后置于载玻片上，从根冠起切取根尖1～1.5 mm的分生组织，将其捣碎，加1～2滴Gi⁃emsa染液，染色10～15 min，盖上盖玻片轻轻敲打使根尖细胞分散良好。每种处理的材料各做10～14个根尖压片。

1.7 镜检 制好的压片置于显微镜下检查，选择其中细胞较分散，染色效果明显的6个压片进行计数。在40×10倍显微镜下观察，选其根尖分生区良好的区域并统计不少于1 000个细胞中微核数，测定其微核千分率和污染指数（PI），并进行统计学分析。

微核千分率=微核数/观察统计的细胞总数× 1 000‰。

PI＝样品实测微核千分率的平均值/对照组微核千分率。

2 结果与分析

2.1 醋酸铅对蚕豆根尖细胞微核发生率的影响不同质量浓度的醋酸铅溶液处理后，蚕豆根尖细胞有丝分裂不同时期均可产生微核，包括单微核和双微核（见图1）。

图1 重金属Pb2+对蚕豆根尖细胞微核的影响

表1 不同质量浓度的Pb2+、Hg2+对蚕豆根尖细胞微核率的影响

不同质量浓度的Pb2+对蚕豆根尖细胞微核率及污染指数（PI）的影响见表1。

由表1可见：醋酸铅能诱发较高频率的微核，6个不同质量浓度的醋酸铅溶液所诱发的微核率与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）。由此可见：Pb2+对蚕豆根尖细胞具有较大的遗传毒害作用。在0.1～10.0 mg/L质量浓度范围内，微核率随醋酸铅浓度的升高而增加，在50.0 mg/L质量浓度时微核率最高（27.73±0.93）；当醋酸铅溶液浓度超过50.0 mg/L时，微核率反而下降。这可能是由于过高浓度的Pb2+溶液引起蚕豆根尖细胞的亚致死性伤害，进而引起细胞反应性降低，或抑制了细胞有丝分裂，甚至造成细胞的死亡，从而最终造成其细胞微核率反而下降的趋势。

而PI的变化与微核率保持一致，总体趋势是随醋酸铅浓度的升高而增加。当醋酸铅溶液质量浓度在50.0 mg/L时，PI达3.82。

2.2 氯化汞对蚕豆根尖细胞微核发生率的影响不同质量浓度的氯化汞溶液处理后，蚕豆根尖细胞有丝分裂不同时期均可产生微核，包括单微核和双微核（见图2）。

图2 重金属Hg2+对蚕豆根尖微核的影响

不同质量浓度的Hg2+对蚕豆根尖细胞微核率及污染指数的影响见表1。

由表1可见：氯化汞也能诱发较高频率的微核，6个不同质量浓度氯化汞所诱发的微核率与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）。由表1可知：低浓度的Hg2（+0.01 mg/L）能诱发较高的微核率，Hg2+对蚕豆根尖细胞具有较大的遗传毒害作用。在0.01～0.10 mg/L浓度范围内，微核率随氯化汞质量浓度的升高而增加，在1.00 mg/L时微核率最高（22.75±0.86）；当氯化汞溶液的质量浓度超过1.00 mg/L时，微核率反而下降，当浓度为6.00 mg/L时，其微核率与对照组（蒸馏水处理）相差最小。这可能是由于过高浓度的Hg2+离子引起蚕豆根尖细胞的亚致死性伤害，进而引起细胞反应性降低或抑制了细胞有丝分裂，甚至造成细胞死亡，从而最终引起其细胞微核率下降。其PI的变化与微核率仍保持一致，随氯化汞溶液质量浓度的升高而增加。当氯化汞溶液质量浓度在1.00 mg/L时，PI达3.13。

3 结论与讨论

细胞质中的微核来源有二：一是断片或无着丝粒染色体环在细胞分裂后期不能定向移动，遗留在细胞质中；二是有丝分裂的作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中〔13〕。微核率的大小可以直接表征染色体DNA受损伤程度〔14〕。通过不同浓度的醋酸铅和氯化汞对蚕豆根尖细胞诱导的微核效应的试验，结果表明：较低质量浓度的醋酸铅（0.1 mg/L）和氯化汞（0.01 mg/L）能极显著地诱发蚕豆根尖微核的形成，且醋酸铅和氯化汞的剂量与蚕豆根尖细胞微核率之间存在一定的剂量——反应关系。

在本试验中，诱发最大微核率离子溶液的质量浓度，Hg2+＜Pb2（+Hg2+诱发最大微核率（22.75±0.86）时的质量浓度为1.0 mg/L，而Pb2+诱发最大微核率（27.73±0.93）时的质量浓度为50.0 mg/L）；在两溶液的质量浓度相同（均为0.1 mg/L或1.0 mg/L）时，氯化汞对蚕豆根尖细胞微核的诱发率大于醋酸铅（浓度为0.1 mg/L时，氯化汞诱发的微核率为19.50± 0.71，醋酸铅为14.90±1.03；浓度为1.0 mg/L时，氯化汞诱发的微核率为22.75±0.86，醋酸铅为18.57± 0.51）。由此可见，氯化汞的遗传毒性大于醋酸铅。

蚕豆根尖微核技术应用的一个主要领域就是检测水体的致突变性，在自然水体方面，引入PI概念后，把微核率与污染程度联系起来，根据测试水样微核率与自来水对照，确定污染指数，再根据污染指数的大小进行水体污染分区。根据《环境监测技术规范》，0.00＜PI≤1.50时，为基本无污染，1.50＜PI≤2.00时，为轻度污染，2.00＜PI≤3.50时，为中度污染，PI＞3.50时，为重度污染。

蚕豆是微核技术检测常用的材料，通过醋酸铅和氯化汞对蚕豆根尖诱导的微核效应试验，可了解到排入生态系统中的微量铅和汞（尤其是汞，极小剂量的汞就能引起较高微核效应的产生）对植物及人体存在的潜在遗传危害，并由此推论排入生态系统中的微量铅和汞可能有致突变作用，会对人体或其他生物体造成危害。

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MCN Effects of the Heavy Metal ions Pb2+and Hg2+on the Vicia faba Root Cell

KONG Lingfang,ZHU Hongqiong,YANG Xiaoxia*
（College of Agriculture and Biology Science,Dali University,Dali,Yunnan 671003,China）

Micronucleus effects of the heavy metal ions Pb2+and Hg2+on Vicia faba root cells were investigated with different concen⁃trations of lead acetate and mercuric chloride.The results showed that within certain range of concentrations,both Pb2+and Hg2+can in⁃duce high micronucleus frequency（MCNF）of Vicia faba root cells with a dose dependent manner,however,MCNF was found not to in⁃crease in a linear pattern with high Pb2+and Hg2+concentration.So Vicia faba could be used as the material for fast detection of the genotoxicity of Pb2+and Hg2+in enviroment.

Pb2+;Hg2+;Vicia faba root cells;MCNF

Q336［文献标志码］A［文章编号］1672-2345（2011）04-0051-03

2011-01-17

孔令芳,助教，主要从事园林植物与观赏园艺研究.

*通信作者：杨晓霞，教授，E-mail:dlxy-yxx@163.com.

（责任编辑 李 明）