周期性机械牵张对肺泡Ⅱ型上皮细胞Cyr61表达的影响

张 燕 武庆平 姚尚龙

(华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科,武汉 430022)

周期性机械牵张对肺泡Ⅱ型上皮细胞Cyr61表达的影响

张 燕 武庆平 姚尚龙＊

(华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科,武汉 430022)

目的 研究周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞对Cyr61表达的影响。方法 对肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞施加周期性机械牵张应力。加载频率0.5H z,加载时间2 h,加载应力分别为5%,15%,30%。加载应力为15%,加载频率0.5Hz,加载时间分别0,15min,30min,60min,120min。每个实验均设立空白对照即不给予机械应力。用PCR法测定Cyr61mRNA的表达,用western法测定Cyr61蛋白含量。结果 随着加载应力的增加和加载时间的延长,Cyr61蛋白含量和mRNA表达均增加(P<0.05);施加不同加载幅度后,Cyr61蛋白含量和mRNA表达均增加(P<0.05)。结论 肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-8的产生和释放与周期性的机械牵张应力呈强度和时间依赖性。

周期性牵张; Cyr61; 肺泡上皮细胞

对于呼吸功能严重受损的病人,机械通气是一种必不可少的治疗手段。但最近二十多年逐渐发现,机械通气治疗其实是一把双刃剑,在提供了一种有效的呼吸支持治疗的同时,还能导致肺部严重的损伤,即机械通气所致的肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)[1]。Cyr61 (cysteine-rich 61,CCN1)是PDEF或转化因子刺激小鼠成纤维细胞产生的细胞因子,因富含半胱氨酸而被命名,它是CCN家族第一个被克隆的基因也是最具代表性的一员。近几年研究表明,Cyr61与机械通气相关性肺损伤密切相关[2]。本研究旨在通过研究周期性牵张对肺泡 Ⅱ型上皮细胞株 A549细胞Cyr61表达的影响,为进一步研究Cyr61与机械通气所致肺损伤的机制奠定基础。

材料和方法

1.材料和试剂

肺癌A549细胞由协和医院中心实验室提供;Cyr61单克隆抗体购于RD公司。

2.细胞培养

肺癌A549细胞由协和医院中心实验室提供,置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,于恒温恒湿CO2孵育箱内孵育过夜。细胞贴壁并50%融合后,用无血清DMEM培养液洗3遍,并换成无血清DMEM培养液,按照以下的设计方案进行加载。

3.细胞牵张模型的建立及实验分组

肺癌A549细胞在在37℃、5%CO2孵箱中进行传代培养。本实验采用细胞拉伸加载装置,该装置加载原理是用一个真空泵抽吸由特制弹性硅胶膜制成的培养皿底部,形成负压使培养皿底部产生拉伸变形,从而使附底生长的细胞受机械牵张。细胞所受力值大小以培养皿底部硅胶膜拉伸应变率(%)表示,拉伸率越大,表示细胞所受张力越大.方案一:加载频率0.5Hz,加载时间2h,加载力分别为5%,15%,30%。方案二:加载应力为 15%,加载频率0.5Hz,加载时间分别为 15,30,60,120min。每个实验均设立空白对照组即不给于机械牵张力,但细胞仍接种于包被I型胶原的6孔板上,进行加载时与加载细胞放在同一细胞培养箱内。

4.半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定Cyr61mRNA表达

消化、收集上述裂解细胞,提取细胞总 RNA。用cDNA合成试剂盒,按照操作说明书合成cDNA。PCR反应中,Cyr61引物序列为,上游引物:5’-TCGTCACCCTTCTCCACTT-3’,下游引物 5’-CGTCACA GACCCACTCCTC-3’,扩增片段大小为113bp。PCR反应条件为:95℃预变性5min,94℃变性 40S,57.7℃40s,72℃60s,35个循环,最后72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭显色,紫外灯下观察。图像用 Foretix 1D软件作灰度扫描,结果以Cyr61和内参照 GAPDH113吸光光度值的比值来反映其相对含量。

5.免疫印记法(Western Blot)检测Cyr61蛋白表达的变化

消化、收集上述细胞,RIPA法提取细胞总蛋白,采用Brad ford法检测提取总蛋白浓度。将蛋白经12%SDS-PAGF电泳分离后,电转4h转移至PVDF膜,37℃5%脱脂奶溶液封闭2h,然后与1:100一抗溶液(一抗为鼠抗人Cyr61单抗)反应过夜,0.1%Tween20磷酸缓冲液漂洗后,再与1:1000辣根过氧化物酶标记的二抗(二抗为羊抗鼠 IgG/HRP)37℃孵育2h,洗膜后进行显色反应,显色后以β-actin为内参照,观察Cyr61蛋白表达强度的变化。

6.统计学分析

采用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析,计量资料以±s表示,组间及组内比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.不同大小机械牵张力对肺癌 A549细胞Cyr61表达的影响。

半定量逆转录聚合酶链反应(图1)和Western Blot(图2)结果显示,随着加载应力的增加,肺癌A549细胞Cyr61表达随着机械牵张力的增加而明显增加。以 GAPDH为参照,加力2h后,Cyr61/GAPDH的相对光密度值,随加载形变率的增大而明显增大,各组间相互比较有显著性差异 (P

图1 牵张组周期牵张不同幅度A549细胞Cyr61 mRNA的表达变化Fig.1 Effect of different stretch strain on mRNA expression of Cyr61 of A549 cell.

图2 牵张组周期牵张不同幅度A549细胞Cyr61蛋白的表达变化Fig.2 Effect of different stretch strain on protein expression of Cyr61 of A549 cell.

表1 不同大小牵张应力作用下A549细胞Cyr61 mRNA和蛋白表达的相对光密度值Table 1 OD of different stretch strain on mRNA and protein expression of Cyr61 of A549 cell

2.不同牵张时间对肺癌A549细胞Cyr61表达的影响

半定量逆转录聚合酶链反应(图3)和Western Blot(图4)结果显示,以 GAPDH为参照,加载应力为15%,加载频率0.5Hz,Cyr61/GAPDH的相对光密度值,随着加载时间的增加,在60min时达到高峰。各组间相互比较有显著性差异 (P

图3 牵张组周期牵张不同时间A549细胞Cyr61 mRNA的表达Fig.3 Effect of different stretch length of time on mRNA expression of Cyr61 A549 cell.

图4 牵张组周期牵张不同幅度A549细胞Cyr61蛋白的表达变化Fig.4 Effect of different stretch length of time on protein expression of Cyr61 A549 cell.

讨 论

机械通气在危重病的救治过程中起着重要作用,但由于呼吸机使用不当引起的呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)又成为临床常见而严重的并发症。目前研究发现,过度通气的机械牵张可导致肺组织生物伤,加重肺损伤,其生物伤的主要表现以肺中性粒细胞渗透,以及支气管肺泡盥洗液(BALF)中高水平促炎介质上调为特征的炎症反应。当细胞受到机械力作用时,通过影响即早基因(early response genes)转录因子的表达如c-fos,c-jun,c-myc和Egr-I启动和调节细胞内酶的活性。已经证明这些即早基因的顺式调节序列中含有张力反应元件(stretch-response elements),而在剪切力反应元件(shear stress-responsive elements)区域含有不同基因结合位点。Copland等利用基因芯片、real-time PCR和激光纤维切割等技术研究证实无病变肺组织进行高潮气量而非损伤性机械通气(V 25/ml,RR 30次/min,ZEEP=0)时即可较早的上调 Egr-1、IL-l、Nur77、BTG2等 l0种基因和下调l2种基因的表达,说明机械通气这可诱发肺内的一些敏感基因较早发生变化【3】。研究报道,通过沉默张力敏感基因,抑制其效应蛋白的合成,可以阻断该类蛋白对肺损伤作用,减轻VILI的程度。

表2 不同大小牵张时间作用下A549细胞Cyr61mRNA和蛋白质表达的相对光密度值Table 2 OD of different stretch length of time on mRNA and protein expression of Cyr6 of A549 cell

Cyr61是PDEF或转化因子刺激小鼠成纤维细胞产生的细胞因子。因富含半胱氨酸(含10%的半胱氨酸残基)而被命名。它是CCN家族第一个被克隆的基因,也是最具代表性的一员。Cyr61广泛存在于人类各种组织器官中,如胎盘、心、肺、脑、胰腺和结缔组织等,在胚胎肾组织中CYR61含量较高,而在胃肠道、前列腺、肝脏、肾脏中其表达相对较低。Cyr61处于细胞内外信号转导通路的下游,调控内皮细胞和成纤维细胞的黏附、迁移与增殖,诱导血管发生,参与炎症反应、伤口愈合和组织重塑过程,研究表明,Cyr61表达与胚胎发育,新生血管形成,软骨形成或创伤愈合的发生、发展过程中发挥不同作用[4]。Tamas等研究发现给小鼠高潮气量通气时,可较早上调Cyr61等十多种基因的表达,说明机械通气这可诱发肺内的一些敏感基因较早发生变化[5]。由此可见,Cyr61是与机械性肺损伤密切相关的张力敏感基因,Cyr61的上调可能引发了一系列生物学反应,参与了肺损伤的进程。研究发现Cyr61与牵张相关生理病理过程有着密切的关系,机械牵张可通过影响Egr-1的转录迅速提高Cyr61在血管平滑肌细胞的表达水平,从而在血管生成早期发挥影响。机械牵张还诱导Cyr61在心肌组织的大量表达,Cyr61是压力超负荷心肌肥大的早期指标,机械牵张通过 PKC,PI3K等多条等通路上调Cyr61在膀胱平滑肌细胞中的表达,Cyr61是平滑肌细胞的分化的早期信号分子,可能与平滑肌细胞肥大的疾病进程相关[6]。但是国内外学者对于牵张引起Cyr61在肺上皮细胞的表达研究较少。Lin等研究发现,Cyr61可与细胞表面的整合素分子结合,激活下游的NF-κB通路[7]。NF-κB是细胞内的一类重要的转录因子,它由P50和P65两个亚基组成,在静息细胞,NF-κB与抑制蛋白(IκB-)结合以三聚体形式存在于细胞质中,当细胞受到适当刺激时,IκB与NF-κB发生解离,NF-κB就激活由细胞质进入细胞核,与靶基因上的特异性序列结合,启动和调节细胞因子和炎症介质的基因转录。细胞学的研究表明,肺上皮细胞受到机械牵拉时NF-κB显著激活,上调多种致炎因子的表达,而NF-κB抑制剂能显著下调张力刺激引起的致炎因子的表达,提示NF-κB可能在机械张力介导肺损伤中起着非常重要的作用。等研究表明,牵张肺癌 A549细胞,NF-κB与IκB-解离,激活由细胞质转入细胞核,并引起下游细胞因子IL-8的表达。总之,NF-κB系统激活后调节致炎因子的表达可能是VILI致病机制的中心环节之一。由此可推断,机械牵张肺上皮细胞导致Cyr61激活,Cyr61与细胞表面的整合素分子结合激活下游的 NF-κB通路。NF-κB系统激活后调节致炎因子的表达,引起肺损伤。

机械应力对细胞的影响与力的大小、频率及持续时间有关。本实验从细胞力学水平研究了周期性牵张对肺泡Ⅱ型上皮细胞Cyr61表达的影响,结果表明机械牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞时,肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞以牵张应力的强度和时间依赖的方式产生和释放Cyr61。这为机械通气性肺损伤在细胞分子水平提供了理论依据,阻断Cyr61的表达可能阻断其下游炎性介质的产生,为机械通气性肺损伤的治疗提供了一个新的靶点,这为进一步研究Cyr61与机械性肺损伤的关系以及深入研究机械性肺损伤的机制和治疗原则奠定了基础。

[1]Dreyfuss D,Basset G,Soler P,et al.Intermittent positive-pressure hyperventilation with high inflation pressures produces pulmonary microvascular injury in rats.Am Rev Respir Dis,1985,132:880-884

[2]Shwu-Fan Ma,Dmitry N Grigoryev,Angela D,et al.Bioinformatic identification of novel early stress response genes in rodent models of lung injury.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2005,289:L468-L477

[3]Copland IB,Kavanagh BP,Engelberts D,et al.Early changes in lung gene expression duo to high tidal volume.Am J Respir Crit Care Med,2003,168:1051-1059[4]Bork P.The modular architecture of a new family of growth regulators related to connective tissue growth factor.FEBS Lett,1993,327(2):125-130

[5]Ying Chen,Xiao-Yan Du.Functional Properties and Intracellular Signaling of CCN1/Cyr61.J Cell Biochem,2007,100:1337-1345

[6]Tama′s,Naftali Kaminski,Martina Felgendreher,et al.Gene expression profiling of target genes in ventilator-induced lung injury.Physiol Genomics,2006,26:68-75

[7]Lin MT,Lin MT,Chang CC,et al.Cyr61 expression confers resistance to apoptosis in breast cancer MCF-7 cells by a mechanism of NF-kappaB-dependent XIAP upregulation.J Biol Chem,2004,279:24015-24023

Effect of cyclic mechanical stretch on Cyr61 expression in typeⅡalveolar epithelial cells

Zhang Yan,Wu Qingping,Yao Shanglong＊

(Department of A nesthesiology of Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,W uhan430022,China)

Objective To investigate the effect of cyclic mechanical stretch of type Ⅱalveolar epithelial cells on the production and release of Cyr61.Methods The typeⅡalveolar epithelial cell line A549 cells were exposed to cyclic mechanical stretch.The experiment was performed in 2 parts.In part 1,A549 cells were exposed to different strains(5%,15%,30%)at the frequency of 0.5 HZfor 2 hours.In part 2,A549 cells were stretched for different lengths of time(15min,30min,60min,120min).RT-PCR and Western blot were used to assess the levels of Cyr61 mRNA and proteins.Results A549 cells subjected to cyclic stretch produced and released cyr61 mRNA and protein in a time and intensity de pendent manner(P<0.05).Conclusion Cyclic mechanical stretch o f typeⅡepithelial cells can induce mRNA and proteins to produce cyr61 in a time and intensity dependent manner.

Cyclic mechanical stretch; Cyr61; Alveolar epithelial cell

〔文献标识码〕A

10.3870/zgzzhx.2011.01.010

2010-11-03

2010-12-06

张 燕,女(1982年),汉族,医学博士。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)