风味蛋白酶水解合浦珠母贝肉制备抗菌肽人工神经网络法优化工艺

吴燕燕，宫晓静,2，李来好，杨贤庆

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306)

风味蛋白酶水解合浦珠母贝肉制备抗菌肽人工神经网络法优化工艺

吴燕燕1，宫晓静1,2，李来好1，杨贤庆1

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306)

利用具有自学习特点的人工神经网络可实现对酶解过程的模拟仿真，研究从合浦珠母贝肉中制备抗菌肽的最佳工艺条件。采用3层(5-9-3)人工神经网络法对风味蛋白酶水解合浦珠母贝肉的工艺过程进行模拟和优化，并通过管碟抑菌法对产物的抑菌性质进行分析。结果表明：pH7.0、水解温度55℃、酶添加量1.6%、水解时间4h、料液比7:5，制备得到肽A，抑制鼠伤寒沙门氏菌最强，抑菌圈直径14.20mm，平均肽链长度2.6；pH7.0、水解温度55℃、酶添加量1.7%、水解时间4h、料液比3:2，制备得到肽B，抑制痢疾志贺氏菌最强，抑菌圈直径23.42mm，平均肽链长度2.8；pH6.5、水解温度60℃、酶添加量2.5%、水解时间4h、料液比7:5，制备得到肽C，对单核细胞增生李斯特菌的抑制效果最强，抑菌圈直径16.60mm，平均肽链长度2.5。3种抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌也具有较强的抑菌效果，抑菌率为74.3%～80.8%。本研究利用人工神经网络优化制备的贝肉抗菌肽克服了纯度低、提取率低等缺点，为合浦珠母贝肉抗菌肽的开发利用提供技术支撑。

合浦珠母贝肉；抗菌肽；制备；人工神经网络优化法

由于当前食品工业上所采用的防腐保鲜剂多为化学合成，从更安全和健康的角度出发，亟需寻找天然高效的食品防腐保鲜剂。抗菌肽由于具有广谱抗菌的特点，从天然产物中获取天然抗菌肽应用于食品防腐保鲜是当前的研究热点，合浦珠母贝(Pinctada fucata)是我国生产海水珍珠主要养殖贝类，随着海水珍珠养殖产量的不断增大，采珠后产生的大量珍珠贝肉急需进行高值化加工利用。由于珍珠贝类本身缺乏类似高等脊椎动物那样的特异免疫系统，其免疫主要依赖于丰富的体液防御系统中的各类免疫因子，其非特异性免疫系统很发达，而抗菌肽是其非特异性免疫系统的重要组成部分，且其生长过程生产珍珠的特异性，因此蕴藏着丰富的抗菌肽。由于海洋环境的复杂性和多样性，海洋无脊椎动物抗菌肽具有比陆生生物抗菌肽抗菌活性更强、更耐热、更耐盐等特性，因而其在食品保鲜、贮藏及加工上的应用具有更广阔的前景。

控制酶解过程制备抗菌肽属于非线性和非稳态系统，传统的正交试验分析方法对因素水平和交互作用的要求有一定的限制，不可避免地要损失一些信息，不能真正获得多因素连续区域中的最优工艺方案。而具有高度的非线性、能够进行复杂的逻辑操作和非线性关系实现的人工神经网络优化法则因其独特的并行性、容错性、自学习性及强大的运算、识别、判断能力适合对此过程的建模及仿真。目前人工神经网络已用于包括干燥、焙烤、挤压、发酵、采后保藏、食品流变学及热处理等食品工业领域[1]。本实验以合浦珠母贝肉为原料，以抑制细菌生长为指标，设计了3层人工神经网络对酶解过程进行模拟和仿真，利用24组试验结果为训练样本，充分挖掘试验信息，从而获得制备合浦珠母贝肉抗菌肽的最优酶解工艺条件，为合浦珠母贝肉的高值化利用提供新的技术。而从珍珠贝肉中制备的海洋天然抗菌肽也将为食品工业提供抑菌效果更佳的天然防腐保鲜剂，具有较大的应用价值和社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

合浦珠母贝肉：购于海南珍珠贝养殖场，－20℃冷冻备用。

风味蛋白酶(20万U/g，食品级) 丹麦Novo公司；牛肉膏蛋白胨培养基 广东环凯微生物科技有限公司。

供试病原菌：鼠伤寒沙门氏菌(S a l m o n e l l a typhimurium)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach) 广东省微生物菌种保藏中心。

1.2 仪器与设备

KjeltecTM2300全自动凯氏定氮仪 丹麦Foss公司；3K30型高速冷冻离心机 德国Sigma公司；BS124S型电子天平、普及型pH计 德国Sartorius公司；DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂；DK-S24型恒温水浴锅 上海森信实验仪器厂有限公司；全自动菌落分析仪 杭州迅数科技有限公司；Akku-drive电子滴定仪 德国赫施曼公司。

1.3 方法

1.3.1 合浦珠母贝肉水解液制备

新鲜贝肉预处理→组织捣碎→酶解→灭酶→离心→超滤→贝肉水解液，4℃保存备用。

1.3.2 菌种活化

在无菌条件下，将菌种接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基的试管斜面上，置于37℃培养箱中培养24h。

1.3.3 菌悬液配制

用接种环从活化后的菌种斜面上刮少量菌，在100mL无菌生理盐水中稀释，振摇均匀，即为浓度1；然后从浓度1的试管中准确吸取1mL，加入到装有9mL无菌生理盐水的试管里混匀，即为浓度2；同浓度2法得到浓度3，备用。

1.3.4 管碟法测抑菌圈直径[2]

培养基应预先灭菌并冷却至40～50℃，从浓度3的试管里准确吸取0.2mL菌悬液，对号放入已编好号的无菌培养皿中(每种菌做3个重复)，将培养基倒入培养皿中(约10～15mL)，迅速轻轻摇匀，水平位置静置30min，使培养基冷凝，制成带菌平板，每个平板上放3个牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的不锈钢杯)，每管加入贝肉酶解液0.2mL，以蒸馏水作为对照(CK)，置于37℃培养箱中培养24h后，用全自动菌落分析仪测其抑菌圈直径。

1.3.5 水解度(degree of hydrolysis，DH)及平均肽链长度(peptide chain length，PCL)的测定

蛋白氮含量采用凯氏定氮法[3]；氨基氮含量采用甲醛滴定法[4]。

式中：N1为水解液中氨基氮含量；N2为原料中粗蛋白氮含量。

1.3.6 单因素试验

1.3.6.1 料液比对抑菌圈直径的影响

将贝肉在pH7.0、水浴温度55℃条件下，调节不同的料液比(g/mL)，即3:1、3:2、3:3、3:4、3:5、3:6，以酶添加量为2.0%加酶后水解相同3h，测定各组水解液的抑菌圈直径。

1.3.6.2 水解时间对抑菌圈直径的影响

其他条件同1.3.6.1节，在料液比3:2条件下，调节不同的水解时间，即2、3、4、5、6、7 h处理贝肉，测定各组水解液的抑菌圈直径。

1.3.6.3 酶添加量对抑菌圈直径的影响

其他条件同1.3.6.1节，在料液比3:2条件下，调节不同的酶添加量，即1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%、3.2%的比例加酶后水解相同3h，测定各组水解液的抑菌圈直径。

1.3.6.4 pH值对抑菌圈直径的影响

其他条件同1.3.6.1节，在料液比3:2的条件下，调节不同的pH值，即pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5条件下保温30min，加酶后将贝肉水解相同3h，测定各组水解液的抑菌圈直径。

1.3.6.5 水解温度对抑菌圈直径的影响

其他条件同1.3.6.1节，在料液比3:2条件下，调节不同的水浴温度，即40、45、50、55、60、65℃的水温水解相同3h，测定各组水解液的抑菌圈直径。

1.3.7 抗菌肽制备条件的优化试验

利用Matlab软件以人工神经网络工具箱进行编程，选用5个输入神经元、隐含层含9个神经元和3个输出神经元的人工神经网络，进行试验设计，优化风味蛋白酶水解合浦珠母贝肉工艺。设定pH值、水解温度、酶添加量、水解时间、料液比5个酶解工艺参数，并以贝肉水解液分别对鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌的抑菌圈效果作为评价指标，进行制备条件的优化试验。

1.3.8 数据处理

采用Matlab2009a和Microsoft Excel软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对抑菌圈直径的影响

图1 料液比对抑菌圈直径的影响Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on inhibitory zone diameters against three bacterial species

由图1可见，料液比对产物的抑菌活性影响显著，在料液比3:2～3:5范围内，抑菌活性较强，当料液比为3:3时，水解液的抑菌活性最高，对鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌的抑菌圈直径分别为11.03、14.32、12.89mm。说明水在一定程度上能疏松贝肉浆液的致密组织，增大酶与底物的接触面积，对提取起到良好的效果，但水用量过高，底物浓度降低，对酶与底物的反应速度有较大影响，单位时间内贝肉抗菌肽的提取率随之降低，因此应当选择合适的料液比。

2.1.2 水解时间对抑菌圈直径的影响

图2 水解时间对抑菌圈直径的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on inhibitory zone diameters against three bacterial species

由图2可见，随着水解时间的延长，产物的抑菌活性先增加后减少，在水解时间3～6h范围内，产物对3种菌的抑菌活性较强。而水解时间大于6h，酶解产物进一步降解形成其他类型的短肽和氨基酸，就得不到具有抑菌特性肽，所以需要在3～6h水解时间中进一步筛选出最佳的的水解时间，既能节约能源，也能得到抑菌活性较高的贝肉抗菌肽提取物。

图3 酶添加量对抑菌圈直径的影响Fig.3 Effect of enzyme dosage on inhibitory zone diameters against three bacterial species

2.1.3 酶添加量对抑菌圈直径的影响由图3可见，酶添加量对产物的抑菌活性影响较显著，当底物浓度不变，增加酶添加量，则催化反应速

度增大，单位时间所生成的产物增加，因此单位时间

内产物的抑菌活性增强，当酶添加量为1.6%～2.4%范围内，得到的肽对鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌的抑菌效果最强，而酶的添加量大于2.4%后，产物的抑菌活性基本趋于稳定。

2.1.4 pH值对抑菌圈直径的影响

图4 pH值对抑菌圈直径的影响Fig.4 Effect of pH on inhibitory zone diameters against three bacterial species

由图4可见，酶解过程pH值对产物的抑菌活性有影响，在pH6.5～8.0范围内时，表现较强的抑菌活性。pH值对产物的抑菌活性的影响程度主要取决于其对风味蛋白酶酶活的影响程度，在pH6.5～8.0范围内，风味蛋白酶的酶活最高，因此其酶解产物的抑菌活性也最强。

2.1.5 水解温度对抑菌圈直径的影响

由图5可见，随着水解温度的增大，产物的抑菌活性先增加后降低，当温度在45～60℃范围内，表现较强的抑菌活性。当温度在55℃，水解产物对鼠伤寒沙门氏菌、和单核细胞增生李斯特菌的抑制作用最强，抑菌圈直径分别为11.89mm、12.98mm；当温度在50℃时，水解产物对痢疾志贺氏菌的抑制作用最强，抑菌圈直径为12.88mm。

图5 水解温度对抑菌圈直径的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on inhibitory zone diameters against three bacterial species

2.2 抗菌肽制备条件优化

2.2.1 人工神经网络试验结果分析与优化

图6 鼠伤寒沙门氏菌(A)、痢疾志贺氏菌(B)和单核细胞增生李斯特菌(C)的抑菌圈直径的误差Fig.6 Errors between ANN predictions and experimental results of inhibitory zone diameters against three bacterial species

根据单因素试验的初步结果，利用Matlab软件以人工神经网络工具箱为依据，进行人工神经网络设计，优化风味蛋白酶水解合浦珠母贝肉工艺，各试验组的编码与取值见表1，人工神经网络的训练样本为24个，采用快速反向传播算法，设定目标训练均方差为10-5，学习速率为0.03，完成训练拟合步数＜500步，组成训练集对人工神经网络进行训练，使之误差达到满意的程度。人工神经网络的预测结果与试验结果的比较见表2，产物的实际抑菌效果与人工神经网络的预测抑菌效果的差异见网络图6。

表1 人工神经网络学习样本输入与输出Table 1 Input and output data for ANN training samples

表2 人工神经网络的预测结果与实测结果比较Table 2 Comparasion between ANN predictions and experimental results

由表2及图6可知，经过训练的人工神经网络具有较好的预测能力，预测结果与实际结果的误差都在± 10%以内，说明该网络拟合度良好，可用此网络来优化风味蛋白酶对合浦珠母贝肉的整个酶解过程。

经该人工神经网络预测：当pH7.0、水解温度55℃、酶添加量1.6%、水解时间4h、料液比7:5，酶解液(肽A)对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性最高，最大抑菌圈直径为15.27mm；当pH7.0、水解温度55℃、酶添加量1.7%、水解时间4h、料液比3:2，酶解液(肽B)对痢疾志贺氏菌的抑菌活性最高，最大抑菌圈直径为23.53mm；当pH6.5、水解温度60℃、酶添加量2.5%、水解时间4h、料液比7:5，酶解液(肽C)对单核细胞增生李斯特菌的抑菌活性最高，最大抑菌圈直径为16.37mm。

2.2.2 验证实验

表3 最佳工艺条件下制备的抗菌肽抑菌性分析Table 3 Antimicrobial activities of three peptide products obtained under optimzed hydrolysis condiitons

按以上人工神经网络所得预测值，即在最优水解参数条件下进行3个平行试验，结果见表3，实验验证肽A对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径为14.20mm；肽B对痢疾志贺氏菌的抑菌圈直径为23.42mm；肽C对单核细胞增生李斯特菌的抑菌圈直径为16.60mm，试验所得实际结果与人工神经网络的预测结果的误差均在±10%以内，证明人工神经网络法具有较好的预测性，对风味蛋白酶酶解制备合浦珠母贝肉抗菌肽的工艺条件具有指导意义。

将利用人工神经网络优化贝肉酶解工艺得到的3种抗菌肽应用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌试验，结果见表3，3种抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌效果，其抑菌率大小与其对鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌的抑菌率大小基本相似，为74.3%～80.8%。综上可证明，合浦珠母贝肉抗菌肽具有抑菌活性高、抗菌广等特点，同时，利用人工神经网络优化制备的贝肉抗菌肽克服了纯度低、提取率低等缺点，为创造可观的合浦珠母贝肉抗菌肽的开发奠定基础。

3 讨 论

抗菌肽类防腐剂由于其安全无毒害、甚至对人体有保健作用而受到人们的广泛关注[7-8]。抗菌肽除具有抗菌作用外，还具有抗病毒、抗肿瘤和抗癌活性，抗菌肽不易导致耐药性，并且对生物体本身无害，符合人类食品安全的要求，因此使得抗菌肽的研究意义越来越重要[9-11]。在抗菌肽研究中，许多学者都用正交试验优化制备抗菌肽，宋宏霞等[12]用正交试验优化制备紫贻贝抗菌肽，金莉莉等[13]用正交试验优化制备林蛙皮抗菌肽，用正交试验优化制备的抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的抑菌圈直径都在10～15mm范围内，抑菌性相对不明显。本实验应用人工神经网络优化制备抗菌肽，由于其推广、概括能力较强，克服了正交试验只能在已定的水平、一定的实验范围内优化的缺陷，因此，可以大大提高实验准确性。另外，人工神经网络优化法具有更高度的非线性和更强大的运算能力，能准确的运算和统计大量的数据，因此可以大大增加试验结果的精确性[14-15]。

通过单因素试验发现料液比和酶添加量对试验结果影响显著，而水解时间、pH值、水解温度对试验结果影响不显著，说明酶与底物的充分接触和酶浓度是整个酶解过程的关键参数。由于风味蛋白酶是粉末，直接与贝肉浆液混合达不到良好的酶解效果，而料水混合的过程是将贝肉浆液稀释的过程，加酶后，酶很快溶于稀释液中，增大了酶与底物的接触面积，使酶与底物很好的结合，达到理想的酶解效果。另外，在酶促反应中，当底物浓度大大超过酶浓度，使酶被底物饱和时，反应速度与酶浓度成正比关系，酶浓度越高，反应速度越快，酶解效果越好，当酶底比达到最佳浓度时，酶解效果达到最佳，并随酶浓度的增加而保持平衡。

在单因素试验基础上，应用人工神经网络优化制备合浦珠母贝肉抗菌肽，根据管碟抑菌法测定结果表明，其对鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌具有较强的抑菌效果，大肠杆菌的抑菌圈直径20.9mm、对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径18.3mm，相比宋宏霞等[12]正交优化后的紫贻贝抗菌肽对大肠杆菌的抑菌圈直径9.8mm、对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径12.5mm，及王辉等[16]正交优化后的牙鲆抗菌肽对大肠杆菌的抑菌圈直径14mm、对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径12mm，本方法更高效，更精确，更经济。

本研究利用人工神经网络优化得到风味蛋白酶水解合浦珠母贝肉制备抗菌肽的最佳工艺条件：pH7.0、水解温度55℃、酶添加量1.6%、水解时间4h、料液比7:5，制备得到肽A，平均肽链长度为2.6，抑制鼠伤寒沙门氏菌能力最强；pH7.0、水解温度55℃、酶添加量1.7%、水解时间4h、料液比3:2，制备得到肽B，平均肽链长度为2.8，抑制痢疾志贺氏菌能力最强；pH6.5、水解温度60℃、酶添加量2.5%、水解时间4h、料液比7:5，制备得到肽C，平均肽链长度为2.5，对单核细胞增生李斯特菌的抑制效果最强。抑菌试验证明3种抗菌肽对鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌均具有较强的抑菌效果，抑菌率为70.2%～83.9%，其中，肽B的抑菌活性最高，其对5种细菌的抑菌率达到75%以上，并且对痢疾志贺氏菌的抑制效果最强，抑菌率达到83.9%。该研究为合浦珠母贝肉抗菌肽的开发利用奠定基础，并且为今后肽B的抗菌谱试验、分离纯化及结构分析等研究提供了可靠的依据。

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Process Optimization for Preparation of Antimicrobial Peptides fromPinctada fucataMuscle by Flavourzyme Hydrolysis Using Artificial Production Neural Network

WU Yan-yan1，GONG Xiao-jing1,2，LI Lai-hao1，YANG Xian-qing1
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, National Research and Development Center for Aquatic Product Processing, Guangzhou 510300, China；
2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

In this paper, artificial neural network (ANN), which can simulate an enzymatic hydrolysis process based on selflearning, was applied to study the optimum conditions for enzymatic preparation of antibacterial peptides fromPinctada fucatamuscle with flavourzyme. The hydrolysis ofPinctada fucatamuscle by flavourzyme was simulated and optimized using a threehierarchy ANN structure. The antimicrobial activity ofPinctada fucatamuscle hydrolysates was tested by cylinder-plate method. The results demonstrated that the peptide A was obtained after 4 h of hydrolysis under the conditions of pH 7.0, 55 ℃, 7:5 material/liquid ratio and 1.6% enzyme/substrate ratio, which showed the strongest antibacterial activity againstSalmonella typhimuriumwith an inhibition zone diameter of 14.20 mm and an average peptide chain length of 2.6. Four-hour hydrolysis under the conditions of pH 7.0, 55 ℃, 3:2 material/liquid ratio and 1.7% enzyme/substrate ratio generated the peptide B, which had the strongest antibacterial activity againstShigella dysenteriaewith an inhibition zone diameter of 23.42 mm and an average peptide chain length of 2.8. The peptide C was obtained under the conditions of pH 6.5, 60 ℃, 7:5 material/liquid ratio, 2.5% enzyme/ substrate ratio and 4 h hydrolysis, which displayed the strongest antibacterial activity againstL.monocytogeneswith an inhibition zone diameter of 16.60 mm and an average peptide chain length of 2.5. The three peptides also had strong antibacterial activity againstEscherichia coliandStaphyloccocus aureuswith an inhibitory rate ranged of 74.3%－80.8%. The applicationof ANN for optimizing antibacterial peptides preparation fromPinctada fucatamuscle overcomes many shortcomings such as low purity and low extraction efficiency and can therefore provide technical supports for the development and exploitation of antibacterial peptides derived fromPinctada fucatamuscle.

Pinctada fucatamuscle；antimicrobial peptides；production；artificial neural network optimization

2011-06-22

海南省重点科技项目(070121；ZDXM20100005)

吴燕燕(1969—)，女，研究员，博士，主要从事水产品加工与质量安全研究。E-mail：wuyy1028@yahoo.com.cn

TS254.1

A

1002-6630(2011)20-0063-06