AccQ·Tag柱前衍生反相-高效液相色谱法测定齿果酸模中的氨基酸含量

高向阳，刘 娜

(河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

AccQ·Tag柱前衍生反相-高效液相色谱法测定齿果酸模中的氨基酸含量

高向阳，刘 娜

(河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

为研究齿果酸模中氨基酸的种类和含量，探讨其营养特性和食用开发价值。以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)为衍生试剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱；在柱温37℃条件下用AccQ·Tag进行柱前衍生，反相-高效液相色谱法用紫外检测器在波长248nm进行测定。结果表明：齿果酸模中含有17种氨基酸，干基总含量为252.35mg/g，有很好的食用开发前景。17种氨基酸线性回归方程的相关系数r在0.9995以上(n＝5)，测定的平均回收率为97.1%～102.6%，相对标准偏差RSD为0.3%～3.2%(n＝3)，测定结果令人满意。

齿果酸模；AccQ·Tag柱前衍生；反相-高效液相色谱法；氨基酸

齿果酸模(Rumex dentatua)，为蓼科酸模属，一年或多年生草本，别名牛舌草、土大黄，牛舌棵子、野菠菜等。主要分布在尼泊尔、印度、阿富汗、哈萨克斯坦及欧洲东南部等国家和地区。我国华北、西北、华东、华中等地区齿果酸模自然资源也极为丰富[1]，但长期以来，该植物的营养特性和食用价值没有受到人们的关注，未见进行研究、开发和充分利用[2]。

氨基酸是生物体不可缺少的营养成分，对促进人体生长发育具有重要作用，目前，主要采用茚三酮柱后衍生，用氨基酸自动分析仪测定。AccQ·Tag法是一种用于肽及蛋白水解氨基酸分析的柱前衍生新技术，用AQC(6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯)为衍生剂，可与所有含氨基化合物快速定量反应生成高稳定性脲(最大吸收波长为248nm)，然后用反相高效液相色谱仪分离衍生产物，用荧光或紫外检测器检测[3]。柱前衍生反相高效液相色谱法(reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)因具有通用性强、选择性好、分离度高、可分析多种物质等显著优点，已被广泛用于样品中氨基酸的测定[4-6]。

齿果酸模中蛋白质和氨基酸等营养物质的测定至今未见文献报道，本实验用AccQ·Tag柱前衍生RP-HPLC分析技术，对郑州地区齿果酸模中氨基酸的种类和含量进行测定，为进一步开发和利用齿果酸模食品自然新资源，提供科学依据和重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

齿果酸模(Rumex dentatua)全株采集于河南省郑州市东风渠旁，叶苗呈新鲜、润亮浅绿色。

AccQ·Tag氨基酸测定试剂盒(包括AccQ·Flour氨基酸专利衍生剂、专用氨基酸分析柱、玻璃样品衍生管)、17种混合氨基酸标准液(浓度均为100μmol/mL)美国Waters公司；磷酸盐缓冲溶液；浓盐酸(AR)；氢氧化钠(AR)；乙腈(色谱纯)；实验用水的电阻率为18.3MΩ·cm，采用美国Millpore公司水处理设备制造。

515高效液相色谱仪(配有2487紫外检测器、色谱工作站) 美国Waters公司；Fw-100型高速万能粉碎机 北京市永光明医疗仪器厂；VIC-412型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；101-2-S-Ⅱ型电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂；SK5200H 型超声波洗涤器 上海科导超声仪器有限公司；XK96-B型快速混匀器 姜堰市新康医疗器械有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱(3.9mm ×150mm，4μm)；流速：1.0mL/min；柱温：37℃；紫外检测波长：248nm；进样量：10μL；流动相A为Waters公司提供的储备液，按1:10(V/V)用水稀释；流动相B为乙腈-水60:40(V/V)；梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3 标准混合溶液的制备

用移液器移取100μL有17种氨基酸的标样，加0.90mL水稀释，混匀，备用。该标准溶液的氨基酸浓度为10μmol/mL。精确吸取10μL于衍生用小管中(6× 50mm)，加入70μL硼酸盐缓冲液，涡旋混合后，在涡旋状态下加入20μL刚配好的AccQ·Fluor衍生剂，保持涡旋混合15s。室温放置lmin后用石蜡膜封口，于50℃烘箱内加热10min，取出冷至室温，供在1.2节色谱条件下进行氨基酸分析[7-8]。

1.4 试液的制备和测定

将新采集的齿果酸模样品洗净风干，在55℃恒温干燥箱中干燥至质量恒定，粉碎后过60目筛。准确称取齿果酸模干样粉末0.1000g置于水解管中，加入6mol/L盐酸10mL，封口，置110℃鼓风干燥箱中水解24h。放冷调pH8～10，用水定容至50.00mL，混匀、过滤，再经0.45μm微孔滤膜过滤，备用[9-11]。

精确吸取滤液10μL于衍生小管中(6×50mm)，加10μL缓冲液，边涡旋边加入20μL衍生试剂后，移至自动进样微量小瓶中，密闭，置于55℃烘箱中10min，取出冷至室温，供在1.2节色谱条件下进行氨基酸分析[12-13]。按下式计算测定结果：

式中：ρB为干基样品中被测氨基酸组分的含量/ (mg/g)；CB为试液中被测氨基酸组分测得的浓度/(μmol/ mL)；m为称样量/g；M被测氨基酸组分的摩尔质量/ (g/mol)。

2 结果与分析

2.1 水解条件的选择

准确称取0.1000g粉末样品置于水解管中，分别加入10mL 4mol/L、6mol/L和8mol/L盐酸，封口，110℃恒温水解18、24h和30h，放冷，调pH8～10，定容至25mL，混匀、过滤，再经0.45μm微孔滤膜过滤后作为试液，在上述液相色谱条件下进行测定。结果表明：110℃用6mol/L盐酸恒温水解24h为最佳水解条件。

2.2 工作曲线

将氨基酸标准混合液配制成浓度为2.5、5.0、10、15、20μmol/mL的系列溶液，各取10μL按1.4节方法衍生后进行5次平行测定，以浓度C/(μmol/mL)为横坐标，以峰面积A/(μV·s)为纵坐标绘制工作曲线，利用峰面积与浓度进行线性回归[14]，按3倍信噪比(RSN=3)计算检出限，结果如表2所示。

表2 氨基酸标准工作曲线(n=5)Table 2 Standard curves and detection limits of 17 amino acids (n = 5)

表2结果表明，在工作曲线浓度范围内，峰面积与氨基酸浓度线性关系良好，相关系数在0.9995以上。

2.3 试液的稳定性

用 AQC(6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯)为衍生剂，与含氨基化合物快速定量反应生成高稳定性脲衍生物，最大吸收波长为248nm，衍生试液在室温下可稳定一周，24h内完成测定，结果良好[15-16]。

2.4 回收率和精密度

精确称取齿果酸模粉末0.0250g置于水解管中，加入10μmol/mL氨基酸标准混合溶液后，按1.4节方法进行加标回收率平行测定(n＝3)，结果如表3所示。

表3 17种氨基酸的加标回收率(n=3)Table 3 Spike recoveries of 17 amino acids (n = 3)

由表3可知，加标回收率在97.1%～102.6%，RSD小于3.3%。

2.5 测定结果

在1.2节色谱条件下，取标准混合液和样品溶液各10μL进样分析，测定峰面积值，同时对样品进行3次平行测定。标准混合液氨基酸分析色谱图见图1A，样品分析色谱图见图1B，测定结果见表4。

图1 氨基酸标准品(A)和样品(B)色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of amino acid standards and sample from Rumex dentatus

表4 齿果酸模氨基酸分析结果(n=3)Table 4 Retention times and contents of 17 amino acids in Rumex dentatus (n = 3)

由图1B和表4可知，齿果酸模干基样品中含有17种氨基酸，氨基酸总量为252.35mg/g，其中人和其他哺乳动物需要的7种必需氨基酸(苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸)含量为72.54mg/g，占总氨基酸含量的28.75%。同时，依据必需氨基酸指数计算公式：EAAI－[(Thrp÷ThrS)×(Tyrp÷TyrS)×(Valp÷ValS)×(Metp÷MetS)×(Lysp÷LysS)× (Ilep÷IleS)×(Leup÷LeuS)×(Phep÷PheS)]×100%得知，齿果酸模中各种氨基酸含量分布合理，非常适宜人体吸收利用[17-19]。

3 结 论

氨基酸在人体中具有重要的生理功能，尤其是必需氨基酸，人体缺乏一种或几种必需氨基酸，就不能维持正常的生长发育。研究表明：齿果酸模中含有17种氨基酸，其中，人体所需的必需氨基酸有7种，必需氨基酸含量占总氨基酸含量的28.75%。在所含氨基酸中，天门冬氨酸含量高达26.46mg/g，占氨基酸总含量的10.49%，对治疗心血管病及泌尿系统疾病有很大的作用。因此，食用齿果酸模可补充人体新陈代谢和肌体生长发育需要的氨基酸，特别是必需氨基酸，能够平衡膳食中氨基酸的不足并具有增强肌体的免疫调节能力，利于人体健康。本研究对于进一步开发齿果酸模新型食品资源，具有一定的积极意义和指导作用。

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Determination of Amino Acid Contents in the Whole Plant ofRumex dentatusby Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography with AccQ·Tag Pre-column Derivatization Method

GAO Xiang-yang，LIU Na
(College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Objective: To determine the composition and contents of amino acids in the whole plant ofRumex dentatusfor further study of its nutritional characteristics and food value. Methods: Amino acids were derivatized by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate (AQC), and then their derivatives were separated on a Waters 515 HPLC system with a column temperature of 37 ℃ using phosphate buffer as mobile phase A and aqueous acetonitrile as mobile phase B in the gradient elution mode and detected at 248 nm using a UV detector. Results: Totally 17 amino acids were found, and the total content of amino acids in samples was 252.35 mg/g. The correlation coefficients of the calibration curves for 17 amino acids were all above 0.9995 (n= 5). The average spike recoveries of 17 amino acids were between 97.1% and 102.6% with a relative standard deviation (RSD) between 0.3% and 3.26% (n= 3).

Rumex dentatus；AccQ·Tag pre-column derivatization；reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC)；amino acids

TS201.4

A

1002-6630(2011)20-0160-04

2010-12-18

河南省重点学科建设项目(10466-X-082301)

高向阳(1949—)，男，教授，大学，主要从事食品分析、食品新资源开发研究。E-mail：ndgaoxy@163.com