HPLC法测定苦参中苦参碱的含量

北京同仁堂科技发展股份有限公司（100079）王春燕

苦参为豆科植物苦参Sophora flavescens Ait. 的干燥根。功效为清热燥湿，杀虫，利尿。用于热痢，便血，黄疸尿闭，赤白带下，阴肿阴痒，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，疥癣麻风；外治滴虫性阴道炎。笔者建立了高效液相色谱法测定苦参中苦参碱的含量，现报告如下：

附表1 线性关系考察

附表2 精密度试验

表3 重复性试验

1 仪器与试药

仪器 Angilent 1100 高效液相色谱仪；色谱柱Angilent ZORBAX Eclips Plus C18（4.6×250mm，5um）；薄层板：青岛海洋化工厂；苦参碱对照品：110805-200306由中国药品生物制品检定所提供；样品：外购；试剂：配制标准溶液及供试品溶液的试剂均为分析纯，液相色谱用试剂为色谱级试剂，液相用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱分析条件 流动相：四氢呋喃—0.3%十二烷基硫酸钠（用磷酸将pH调值调至3.0）（21：79）。流速：1.0ml/min。柱温：20℃。检测波长：210nm。进样量：对照品5ul，样品5ul。层析柱的理论板数：以苦参碱峰计算应不低于5000。

2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末0.3g，精密称定，置100ml 磨口三角瓶中，加入乙醇20ml，浓氨水0.5ml，密塞，超声提取（功率250W，频率40Hz）20分钟，提取液用滤纸过滤，药渣和滤纸用乙醇洗涤3 次，每次5ml，合并滤液，于75℃水浴中回收溶剂，残渣用流动相定容至10ml量瓶中，摇匀。经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

附图1 苦参碱的标准曲线

2.3 标准曲线的制备 精密称取苦参碱对照品18.9mg，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取苦参碱对照品溶液（0.756mg/ml）0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别吸取对照品溶液10ul注入液相色谱仪，测得峰面积，结果见附表1。以对照品进样量（ug）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（见附图1），结果表明苦参碱在0.0756～0.756ug范围内呈良好的线性关系。回归方程为Y=1697.18558X+0.251635，r=0.99998（n=6）。

2.4 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，重复进样6次，测定峰面积，RSD ＜ 3%，结果见附表2。

2.5 重复性试验 按正文方法，对同一批样品6份，进行测定，RSD ＜ 3%，结果见附表3。

2.6 空白试验 空白溶液的制备是按处方中药味比例，自配不含苦参的其他药材，按其工艺制成空白制剂，再按【含量测定】项下供试品溶液制备方法制备并测定，空白溶液在与苦参碱对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为空白无干扰（见附图2）。

2.7 稳定性试验 按正文方法对同一批样品分别于配制后0，1，2，6，12，24小时，依法测定，结果表明，供试品溶液在24小时内稳定。RSD ＜ 3%。

2.8 回收率试验 采用加样回收法。精密称取已知含量的同一批号样品0.2g，置100ml三角瓶中，共6份，分别精密加入苦参碱对照品溶液（0.750mg/ml）1.0ml，按照正文供试品溶液的制备方法制备及上述色谱条件测定，按下式计算回收率，结果见附表4。

附表4 回收率试验

附表5 样品测定结果

3 样品测定结果

取3批样品，分别按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按正文含量测定方法进行测定，结果见附表5（苦参碱对照品色谱图见附图3，苦参色谱图见附图4）。

4 讨论

4.1 苦参是一种常用的中药材，中国药典2010版中苦参【含量测定】采用氨基色谱柱分离，因为关于用ODS色谱柱分离苦参中苦参碱的报道很多，ODS色谱柱现使用较普遍，所以选用了ODS色谱柱。

附图2 苦参的苦参空白的高效液相色谱图

附图3 苦参碱对照品高效液相色谱图

4.2 流动相选择为四氢呋喃—0.3%十二烷基硫酸钠（21：79），比较样品在不同pH值的流动相中的分离情况，结果磷酸调pH值至3.0的苦参碱峰的分离度合格（R＞1.5），而且分离效果最佳。

4.3 比较样品在不同浓度0.2%、0.3% 、0.4% 的十二烷基硫酸钠的离子对试剂的流动相中的分离情况，结果四氢呋喃—0.3%十二烷基硫酸钠（21：79，磷酸调pH值至3.0）的保留因子适宜，分离效果最佳。

4.4 比较样品在不同柱温20℃、25℃、30℃时的分离情况，结果柱温20℃时，苦参碱峰的分离效果最佳。

4.5 比较了水、甲醇和流动相为定溶溶剂的图谱，结果表明：以流动相为定溶溶剂，基线稳定，系统适应性强，样品无需氧化铝萃取小柱净化，从而简化了样品处理过程。

附图4 苦参高效液相色谱图