人单链白细胞介素12的原核表达和生物学活性鉴定＊

周鹤峰，邵 敏，姬可平，葛正龙

（1.遵义医学院珠海校区生物工程系，广东珠海519041；2.遵义医学院生物化学教研室，贵州遵义563003）

人单链白细胞介素12的原核表达和生物学活性鉴定＊

周鹤峰1，邵 敏1，姬可平1，葛正龙2△

（1.遵义医学院珠海校区生物工程系，广东珠海519041；2.遵义医学院生物化学教研室，贵州遵义563003）

目的 构建含人单链白细胞介素12（hscIL－12）基因的原核表达载体，在大肠杆菌中表达具有活性的hscIL－12。方法 PCR法从质粒pCA13－hscIL－12中扩增hscIL－12基因，经酶切、连接构建原核表达载体pET28a（＋）－hscIL－12，转入到大肠杆菌BL21（DE3）中，用异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，收集菌液进行蛋白质印迹分析，经镍柱亲和层析（Ni2＋－NTA）纯化，体外增殖实验检测其生物学活性。结果 PCR扩增、双酶切及DNA序列测定证实pET28a（＋）载体上成功插入了hscIL－12基因片段。表达产物经SDS－PAGE电泳分析，证明其相对分子质量为70×103；蛋白质印记表明重组蛋白具有hscIL－12抗原活性；表达产物纯化、复性后进行体外生物学活性实验表明，该重组蛋白能刺激外周血单核细胞（PBMC）产生IFN－γ。结论 pET28a（＋）－hscIL－12原核表达载体的构建和重组hscIL－12蛋白的制备为进一步研究hscIL－12生物学功能和临床应用奠定了基础。

人单链白细胞介素12；大肠杆菌；生物学活性；表达

白细胞介素12（interleukin 12，IL－12）又名自然杀伤细胞刺激因子（NKSF），或称为细胞毒淋巴细胞成熟因子（CLMF），它是由抗原呈递细胞，如巨噬细胞、B淋巴细胞等在免疫应答过程中产生的具有多种生物学活性细胞因子。它能促进T细胞和自然杀伤细胞的增殖，诱导干扰素（IFN）－γ等多种细胞因子的产生，调节Th0细胞向Th1细胞分化发育，具有较强的抗肿瘤、抗病毒、抗感染的作用［1］。IL－12是由P40和P35两个亚基通过二硫键构成的异二聚体细胞因子［2］，只有当这两个亚基形成异源二聚体时，IL－12分子才具有生物活性［3］，单个P40或P35亚基的过量表达还会产生活性抑制作用［4］。本实验使用的人单链IL－12（human single chain IL－12，hscIL－12）全长基因由编码P40和P35的2个基因经一段接头序列连接而成，用其构建原核表达载体，经大肠杆菌BL21进行诱导表达并获得了有活性的重组hscIL－12，为进一步研究hscIL－12生物学功能和临床应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 质粒 pCA13－hscIL－12、原核表达载体pET28a（＋）、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）由本室保存。

1.1.2 试剂 限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶为TaKaRa公司产品；高保真即用PCR扩增试剂盒、UNTQ－10柱式DNA胶回收试剂盒为上海生工生物工程公司产品；镍离子亲和层析柱（Ni2＋－NTA）购自Qiagen公司；ECL化学发光试剂盒试剂盒购自武汉博士德公司；鼠抗人IL－12单克隆抗体购自R＆D公司；羊抗鼠IgG－辣根过氧化物酶（HRP）购自武汉博士德公司；IL－12国际标准品、人IFN－γ酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自R＆D公司；其余化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3 寡核苷酸引物设计与合成 根据GenBank中hsdlL－12的cDNA序列设计引物，由上海生工生物工程公司完成。上游引物：5′－CTAGCT AGCATG GGT CAC CAG CAG T－3′（划线部分为NheⅠ酶切位点），下游引物：5′－ACCGGAG CTCTTA GGA AGC ATT CAG－3′（划线部分为SacⅠ酶切位点）。

1.2 方法

1.2.1 hscIL－12的 PCR 扩增 以质粒pCA13－hscIL－12为模板，在50μL反应体系中，加入上、下游引物各3μL，模板pCA13－hscIL－12 1μL，2×PCR Master 25μL，扩增条件为94℃预变性10min，94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸8min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.2 重组原核表达质粒的构建和鉴定［5］PCR产物与表达载体pET28a（＋）分别用限制性内切酶NheⅠ和SacⅠ双酶切后，用回收试剂盒回收，连接回收的目的基因与原核表达载体片段，并转化感受态DH5α，挑取阳性菌落进行扩增并小量提取质粒进行酶切鉴定。鉴定阳性的菌株送上海生工进行生物工程公司测序。

1.2.3 hIL－12蛋白的诱导表达及纯化 将测序正确的质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，筛选阳性克隆。将阳性克隆接种于含卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养至OD（600）为0.5，经异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG），终浓度为1mmol/L，进行诱导表达4h［6］，菌液离心弃上清，超声裂解菌体，收集上清及裂解物沉淀行SDS－PAGE电泳。彻底溶解裂解物沉淀，用镍柱亲和层析法Ni2＋－NTA纯化目的蛋白，按照Qiagen公司Ni2＋－NTA使用说明书进行，纯化蛋白经过透析复性，SDS－PAGE电泳和薄层扫描分析蛋白纯度，对蛋白进行冻干保存准备用于活性检测。

1.2.4 蛋白质印迹分析 将上述诱导后的裂解菌液进行SDS－PAGE电泳后，参考文献［7］进行，电转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1h，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤；与一抗室温反应2h，PBS洗涤；与HRP标记的二抗室温反应2h，洗涤；用ECL试剂室温孵育1min，进行暴光、显影和定影。以未经诱导的细菌裂解液和用空载体转化的细菌诱导物作对照。

1.2.5 重组蛋白生物学活性测定 分离人外周血单个核细胞（PBMC），用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基调整活细胞浓度为1×106个/mL，向96孔板中每孔加入细胞悬液100μL。将标准品用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成2ng/mL，原核表达的不同浓度的重组hscIL－12蛋白，分别按每孔100μL加入含有细胞悬液的96孔板中，每组设3个复孔，置37℃、5%CO2培养箱中孵育24h后，收集上清液用ELISA试剂盒测定IFN－γ的含量，操作步骤按试剂盒说明书完成。

1.3 统计学处理 所有数据用SPSS11.5统计软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 原核表达载体 pET28a（＋）－hscIL－12的鉴定 以质粒pCA13－hscIL－12为模板，PCR扩增hscIL－12cDNA。将hscIL－12克隆入pET28a（＋）中，构建重组原核表达载体pET28a（＋）－hscIL－12，重组质粒经PCR扩增和 NheⅠ、SacⅠ双酶切鉴定，可见大小约1 600bp的条带，经测序证实结果正确，表明原核表达载体构建成功，见图1。

2.2 重组蛋白的表达与纯化 将重组基因工程菌经IPTG诱导，超声裂解后，对全菌裂解液进行SDS－PAGE分析，相对分子量为70×103的外源蛋白表达水平大大提高，该蛋白质的相对分子质量与hscIL－12融合蛋白理论相对分子质量一致，见图2，镍柱亲和层析后获得了纯度在95%以上的hscIL－12蛋白。

2.3 重组蛋白质印迹鉴定 蛋白质印迹分析表明，经IPTG诱导后的菌体裂解液能与抗体发生特异反应，经ECL显色，曝光，胶片上在相对分子质量为70×103处出现特异性反应条带，见图3，与目的蛋白带一致，而空载体未见显色反应。

图1 pET28a（＋）－hscIL－12的PCR和酶切鉴定

图2 pET28a（＋）－hscIL－12在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的SDS－PAGE分析

图3 诱导表达菌体的蛋白质印迹分析

2.4 hscIL－12生物活性测定 以浓度为5ng/mL的蛋白标准品和浓度分别为2、4和6ng/mL的重组hscIL－12蛋白作用于人PBMC，同时以PBS作为对照，检测IFN－γ表达量分别为（712.5±37.5）pg/mL、（243.8±11.9）pg/mL、（467.6±32.1）pg/mL、（746.2±39.5）pg/mL，PBS对照组表达量为（21.5±8.6）pg/mL。经统计学处理，标准品和不同浓度梯度原核表达的hscIL－12分别与PBS空白对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），表明原核表达的hscIL－12能够促进PBMC产生IFN－γ，证明重组原核表达载体能够表达有生物活性的hscIL－12。

3 讨 论

IL－12是一种重要的细胞因子，由P40和P35 2个亚基经二硫键共价结合而成的异源二聚体［8］。一级结构P40有306个氨基酸，含4个理论糖基化位点和10个半胱氨酸；P35有197个氨基酸，含3个理论糖基化位点和7个半胱氨酸［9］。hs IL－12是一个多功能的免疫调节因子，具有较强的抗肿瘤和抗转移的作用［10］，而且不良反应小。

提高蛋白表达量的首要因素，是选择适合的载体与宿主菌［11］。本研究选用了T7表达系统中的pET28a表达载体。pET系列载体以T7为启动子，可使目的基因得到高效转录与翻译。由于该表达系统在目的表达产物的N端融合了一段6个组氨酸标签序列，有利于天然条件下用金属鳌合层析进行融合蛋白的纯化，本实验使用Ni2＋－NTA纯化目的蛋白，Ni2＋与组氨酸结合，在纯化过程中分辨率高、选择性好、操作方便，可获得的重组蛋白纯度高。而组氨酸标签相对分子质量小，无生物活性，一般对重组蛋白的功能无影响。与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统蛋白表达量高，容易纯化，且具有遗传背景清楚、成本低、培养周期短、抗污染能力强等特点［12］。

本实验成功将hscIL－12克隆入原核表达载体pET28a（＋）中，在大肠杆菌BL21（DE3）获得高效表达。表达产物以包涵体的形式存在，包涵体的形成，可使在胞内表达的外源蛋白不易被细菌的蛋白酶所降解，同时也有利于重组蛋白的分离纯化。包涵体经过洗涤、溶解、Ni2＋－NTA纯化以及蛋白质的复性等步骤后，获得了纯度约为95% 的重组hscIL－12蛋白，蛋白质印迹表明重组蛋白具有hscIL－12抗原活性。经纯化、复性后的表达产物进行体外实验表明，表达hscIL－12能刺激PBMC产生IFN－γ，提示该重组蛋白具有生物学活性。本研究成功实现hscIL－12蛋白在原核系统中的表达，为其进一步的理论研究和临床应用奠定基础。

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Prokaryotic expression and bioactivity identification of single chain human interleukin－12＊

Zhou Hefeng1，Shao Min1，Ji Keping1，Ge Zhenglong2△
（1.Department of Bioengineering，Zhuhai Campus，Zunyi Medical College，Zhuhai，Guangdong519041，China；2.Department of Biochemistry，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou563003，China）

Objective To construct the expression vector of human single chain interleukin－12（hscIL－12）gene.It can express hscIL－12with bioactivity in escherichia coli.Methods hscIL－12gene was amplified from recombinant pCA13－hscIL－12.With restricted enzyme digestion，gene of interest was cloned into the prokaryotic vector pET28a（＋）to construct expressing plasmid of pET28a（＋）－hscIL－12.After pET28a（＋）－hscIL－12was transformed into escherichia coli BL21（DE3），the bacteria were induced by IPTG.The expression of hscIL－12was detected by Western bloting.The hscIL－12protein was purified by Ni－NTA affinity chromatography.The bioactivity of hscIL－12was detected by PHA－activated peripheral blood mononuclear cell（PBMC）proliferation assay.Results PCR and restriction enzyme digestion and DNA sequencing indicated that hIL－12gene was inserted into the procaryotic expression vector pET28a（＋），SDS－PAGE analysis showed that molecular weight of the expressed protein was 70×103；Western blotting analysis showed that recombinant protein had the antigenicity of hscIL－12.The purified hscIL－12protein had the bioactivities in stimulating the IFN－γproduction of human PBMC.Conclusion The construction of the recombinant plasmid and the preparation of the active protein of hscIL－12have laid a foundation for further studying the function and clinical applications of hscIL－12.

interleukin－12；escherichia coli；bioactivity；expression

10.3969/j.issn.1671－8348.2011.31.002

A

1671－8348（2011）31－3124－03

贵州省科委重大攻关项目（2004NGZ002）；贵州省教育厅重点项目（2004118）。△

，Tel：（0852）8608572；E－mail：zbngge@hotmail.com。

2011－05－09

2011－07－14）