RP-HPLC法测定水果中的蛇麻醇酯

肖维强，黄桂颖，戴宏芬，陈悦娇，黄炳雄，马应丹，王晓容,*

(1.广东省农业科学院果树研究所，广东 广州 510640；2.仲恺农业工程学院，广东 广州 510225)

RP-HPLC法测定水果中的蛇麻醇酯

肖维强1，黄桂颖2，戴宏芬1，陈悦娇2，黄炳雄1，马应丹2，王晓容1,*

(1.广东省农业科学院果树研究所，广东 广州 510640；2.仲恺农业工程学院，广东 广州 510225)

应用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)建立蛇麻醇酯简便的分析方法。分析条件为：色谱柱Nucleosil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A为甲醇和水(甲醇:水=20:80)，用体积分数50%的磷酸调pH值至3.2±0.05，流动相B为甲醇(含0.01%的磷酸)，A:B=4:96，流速1.2mL/min，检测波长为210nm，柱温40℃。蛇麻醇酯的标准曲线为5～250μg/mL 7个治疗质量浓度梯度，y=4.6068x＋11.2640，R2=0.9992。精密度实验结果：连续5次进样，保留时间 RSD为0.2107%，峰面积的RSD为1.2843%；同一样品，在0～48h内9次进样，保留时间的RSD为0.3383%，峰面积的RSD为1.9737%。准确度实验结果：回收率为94.971%～101.964%，回收率的RSD为2.5825%。仪器的最低检出限为1.8886μg/mL。被测定的几种水果(青果、草莓、香蕉、巨峰葡萄、美国红提、番木瓜)中，以青果(干粉)中含量最高，达359μg/g以上。本研究建立的分析条件，能满足水果等样品中蛇麻醇酯定性定量分析的需要。

反相高效液相色谱法(RP-HPLC)；蛇麻醇酯；水果

蛇麻醇酯(lupeol)，别名羽扁豆醇、羽扁醇等，属三萜系化合物，由于在羽扁豆(Lupinus luteus)种子中存在而得名[1]。据报道：蛇麻醇酯存在于许多种水果和药用植物中，如白色甘蓝、绿胡椒、草莓、橄榄、芒果、葡萄等[2]；蛇麻醇酯对鼠皮过氧化苯甲酰诱导的皮肤癌具有有效的抑制作用[3]；可阻断前列腺癌细胞中生存素(survivin/cFLIP)的激活，抑制来源于人类雄性激素的肿瘤的生长，有可能作为其他微管剂的辅助剂，发展成为一种人类CaP治疗的潜在剂[4]；蛇麻醇酯可减少人体肝细胞瘤细胞中甘油三酯和胆固醇的合成[5]，蛇麻醇酯和它的酯化派生物对血胆脂醇过多诱导产生的氧化和发炎具有治疗作用[6]；蛇麻醇酯在瑞士白化变种鼠中由DMBA 引起的DNA烷化损害上具有预防作用[7]；蛇麻醇酯在体内和体外系统中还显示出了一些生物活性，如抗炎、治风湿、抗诱变、抗变、抗疟等，为一个强有力的抗肿瘤剂，已发现的大量高活性的派生物显示出更强的效力和更好的治疗指数，证实了蛇麻醇酯的化学预防前景并揭示了潜在的化学预防靶标，主要是细胞周期调解途径基因，并设法解释作用后的运作机制[8]。因此，蛇麻醇酯是一个新发现的强有力的抗癌物质，有关此物质的反相高效液相色谱分离及在水果和蔬菜中的定性定量测定，国内外少报道。Mathe等[9]曾报道过用HPLC法测定了15种三萜系化合物，分离时间达70min；Martelanc等[10]应用HPLC/MS等方法测定了白色甘蓝中的蛇麻醇酯，并建立了较简便快捷的分离方法。本实验在蛇麻醇酯的反相高效液相色谱法(reverse-phase highperformance liquid chromatography，RP-HPLC)分离[11]基础上，拟建立蛇麻醇酯的简便分析方法，用于样品中蛇麻醇酯含量的快速测定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

橄榄(又名青果，品种：八枝香)，取自广东省普宁市成熟期果实；番木瓜采自广州市郊，成熟期(三划黄)的果实，品种为穗中红；草莓、香蕉、芒果、葡萄等均市售水果。

蛇麻醇酯标准品(批号为049K0996) 美国Sigma公司；甲醇(色谱级) 德国Merck公司；其余试剂均为国产分析纯；实验用水为自制双蒸水。

1.2 仪器与设备

1100型高效液相色谱仪(配Agilent化学工作站和DAD检测器，自动进样器) 美国Agilent公司；分离柱(填料为Nucleosil C18反相柱，250mm×4.6mm，5μm，卡套柱) 德国Macherey-Nagel公司。

1.3 样品前处理

将青果、番木瓜、草莓、香蕉、芒果、葡萄等去核(或者皮)，切成小块，于65℃烘箱中烘干后打粉，60%以上过60筛目，其余颗粒直径在1mm左右为宜，65℃烘至质量恒定，保存于干燥器中。

1.4 样品中蛇麻醇酯的提取

各样品中蛇麻醇酯的提取按文献[9]和[11]进行，分别称取各样品干粉2g左右于25mL容量瓶中，加入甲醇15mL浸泡12～18h，超声波提取30min，用甲醇定容，充分混匀后取上清液经0.5μm的微孔膜过滤后上机分析，均重复3次。

1.5 RP-HPLC条件

蛇麻醇酯的RP-HPLC分析条件按参考文献[11]的方法并加以改进。色谱柱为Nucleosil C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A：甲醇-水(甲醇:水=20:80，V/V)，用体积分数50%的磷酸调pH值至3.2±0.05，流动相B：甲醇(含0.01%的磷酸)，A:B＝4:96；流速1.2mL/min；检测波长为210nm；柱温40℃。

1.6 标准曲线的制作

将蛇麻醇酯标准品用流动相溶解，配制成最高含量为250μg/mL标准溶液，然后逐级稀释，分别为200、150、100、50、10、5μg/mL 7个质量浓度梯度。按1.5节色谱条件进行分析，进样量为20μL。根据峰面积和标准品质量浓度，经Excel计算，得线性回归方程和相关系数(R2)。

1.7 精密度及稳定性实验

选择200μg/mL的标准品，连续5次进样，和在0～48h内多次进样，进样量均为20μL。对0、1、2、4、9、12、24、36、48h共9个点的分析结果，计算标准品峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)。

1.8 准确度实验

参照戴宏芬等[12]的方法进行回收实验。按1.4节方法，称取青果干粉1g于10mL容量瓶中，加入最终质量浓度50μg/mL的蛇麻醇酯标准品，以不加标准品的青果样品和50μg/mL的蛇麻醇酯为参照，样品的处理方法同1.4节。根据峰面积计算回收率和回收率的相对标准偏差(RSD)。

1.9 仪器最低检出限

根据仪器提供的软件，计算仪器的最低检出限。

2 结果与分析

2.1 蛇麻醇酯标准品的分离

图1 蛇麻醇酯标准品RP-HPLC图Fig.1 RP-HPLC of standard lupeol

按1.5节中的RP-HPLC条件，蛇麻醇酯标准品的分离图如图1所示。蛇麻醇酯标准品在RP-HPLC条件下得到了良好的分离，在波长210nm时，能与其他杂质分开，保留时间为12.808min。

2.2 蛇麻醇酯标准曲线

按1.6节中7个点标准品的质量浓度梯度，经计算，5～250μg/mL线性关系良好，蛇麻醇酯的标准曲线为y= 4.6068x＋11.2640，R2=0.9992。

2.3 仪器精密度及标准品稳定性结果

选择200μg/mL的标准品溶液，连续5次进样，其保留时间的相对标准偏差(RSD)为0.2107%，峰面积的RSD为1.2843%。

稳定性实验结果表明，多次进样其保留时间的RSD为0.3383%，峰面积的RSD为1.9737%。上述结果说明仪器稳定且精密度高，标准品在48h内稳定。

2.4 准确度实验结果

表1 准确度实验结果Table 1 Results of recovery rate experiments

由表1可见，样品的回收率为94.971%～101.964%，平均回收率为98.397%，回收率的RSD值为2.5825%，此结果说明本实验分析方法可靠。

2.5 仪器最低检出限

本仪器对蛇麻醇酯的最低检出限为1.8886μg/mL(RSN=2)，能满足仪器条件对样品分析的要求。

2.6 多种水果中蛇麻醇酯含量的RP-HPLC测定

图2 青果中蛇麻醇酯的RP-HPLC图Fig.2 RP-HPLC of lupeol in Chinese olive

根据上述所设定的分析条件和样品的处理方法，被测定的几种水果中蛇麻醇酯的含量(以干粉计算)分别为青果(八枝香)359μg/g以上、草莓298μg/g、香蕉92μg/g、巨峰葡萄8μg/g、美国红提9μg/g、番木瓜(穗中红)70 μg/g以上，以青果中含量最高，其次是草莓，芒果含量最少。青果干粉中蛇麻醇酯RP-HPLC分离图谱见图2。样品中的蛇麻醇酯基本能与其他杂质分开，并能积分做定量分析。

3 讨论与结论

蛇麻醇酯是近几年来人们发现的具有强抗癌作用的一种天然三萜系化合物，存在多种水果、蔬菜和药用植物中[2-3,5]。据中国香港大学一项研究成果(2007年10月17日文滙报美洲版)报道：“一种蔬果中天然含有的物质-蛇麻醇酯，抑制头颈癌的功效比化疗药强3倍，与化疗药混合使用，疗效更较单独使用化疗药高40倍，以蔬果天然含有的蛇麻醇酯来制抗癌药，不含毒性，副作用将大大减低”。

有关蛇麻醇酯的简便分析方法国内外研究者很少，试剂公司提供本标准品的分析方法为薄层色谱法，这种分析方法对于定量分析的准确度和精确度均不高。有研究采用HPLC法分析蛇麻醇酯，与其他三萜系化合物同时分离，其分离时间长达70min以上[9]，不经济也不快捷。本研究在Martelanc等[10]对蛇麻醇酯较简便快速分析的基础上，改用甲醇为主要流动相，可使蛇麻醇酯标准品和样品中的蛇麻醇酯得到快速分离，分离时间为12.808min，同时也较为经济。本实验分析的青果(橄榄)中含有高含量的蛇麻醇酯，经液相/质谱(LC/MS)验证，结果一致的[11]。因此，本研究建立的蛇麻醇酯RP-HPLC快速分离方法，能满足样品分析的需要。

[1] 谭仁祥, 孟军才, 陈道峰, 等. 植物成分分析[M]. 北京: 科学出版社,2002.

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[3] SALEEM M, ALAM A, ARIFIN S, et al. Lupeol, a triterpene, inhibits early responses of tumor promotion induced by benzoyl peroxide in murine skin[J]. Pharmacological Research, 2001, 43(2): 127-134.

[4] SALEEM M, MURTAZA I, WITKOWSKY O, et al. Lupeol triterpene,a novel diet-based microtubule targeting agent: disrupts survivin/cFLIP activation in prostate cancer cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, 388(3): 576-582.

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Determination of Lupeol in Fruits by RP-HPLC

XIAO Wei-qiang1，HUANG Gui-ying2，DAI Hong-fen1，CHEN Yue-jiao2，HUANG Bing-xiong1，MA Ying-dan2，WANG Xiao-rong1,*
(1. Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China；
2. Zhongkai University of Agriculture and Engineering , Guangzhou 510225, China)

A simple method was developed for determining lupeol in fruits by reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Separation was carried out on reversed-phase Nucleosil C18 column (5μm, 250 mm × 4.6 mm i.d.) by using a mixture of methanol and water (20:80, pH 3.2 ± 0.05 adjusted by 50% phosphoric acid) as mobile phase A, and methanol containing 0.01% phosphoric acid as mobile phase B (A:B = 4:96) at a flow rate of 1.2 mL/min. The column temperature was hold at 40 ℃, and the detection wavelength was set as 210 nm. The correlation coefficient of the linear calibration curve (y = 4.6068x + 11.2640) was 0.9992 at the concentration range of 5 to 250μg/mL. The relative standard deviations(RSDs) of retention time and peak area in precision experiments for 5 replicate analyses and 9 replicate analyses in 48 h were 0.2107% and 1.2843%, and 0.3383% and 1.9737%, respectively. The recovery rate range was between 94.971% and 101.964%with a RSD of 2.5825%. The detection limit of this method was 1.8886μg/mL. The content of lupeol in dried Chinese olive powder was 359 μg/g, which was higher than that in strawberry, banana, Jufeng grape, American red grape and papaya. Therefore, the developed method is practicable for qualitative and quantitative determination of lupeol in fruits.

reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)；lupeol；fruit

TS207.3

A

1002-6630(2011)10-0183-03

2010-08-30

广东省科技厅农业攻关项目(2006B20201045)

肖维强(1968—)，男，高级农艺师，硕士，研究方向为果品加工及水果中保健成分的分析。E-mail：xwq6817@126.com

*通信作者：王晓容(1954—)，女，研究员，本科，研究方向为仪器分析。E-mail：wang999983@126.com