基于脲酶催化和酸碱指示剂变色原理的高脲乳快速检测方法的建立

杨水云，郑 潇，韩 禹，隆永秋，刘永青

(西安交通大学生命科学与技术学院，线粒体医学研究所，生物医学信息工程教育部重点实验室，陕西 西安 710049)

基于脲酶催化和酸碱指示剂变色原理的高脲乳快速检测方法的建立

杨水云，郑 潇，韩 禹，隆永秋，刘永青

(西安交通大学生命科学与技术学院，线粒体医学研究所，生物医学信息工程教育部重点实验室，陕西 西安 710049)

针对市场上存在的高脲乳(掺假和病理性)问题，建立区别于正常生理浓度范围的快速检测方法。检测方法依据尿素被酶解导致的pH值升高幅度与其浓度呈正相关这一机理，对牛乳起始pH值进行优化调整为6.8时，选择溴百里酚蓝作为指示剂，可以使乳脲含量达40mg/100mL生理上限卡切值以上时变色，从而区别检出高脲问题乳。研究表明，依此组装的高脲乳检测试剂盒，可用于生产实践。

尿素掺假乳；病理性高脲乳；检测试纸；检测试剂盒；脲酶；乳脲氮

尿素，别名脲，碳酰胺，是含氮化合物在哺乳动物肝脏内经由尿素循环产生，之后融入血液，最后通过肾脏由尿排出体外。在体内，血尿素可以扩散进入动物乳中，因此是乳正常组分之一。通常称作乳脲氮或MUN(milk urea nitrogen)，以乳液中的尿素含量/(mg/100mL)表示[1-2]。虽然尿素是低毒的，在体内可达很高浓度水平，但是若超过生理上限卡切值，则会引起人体严重的健康问题，如消化不良、酸血症、胃溃疡、肾功能异常甚至癌症等[3]。

近些年来，乳脲的检测方法研究越来越受到重视。导致乳脲含量升高的因素有2个，一方面因奶牛的营养不平衡或者病理性乳牛造成的生理性高尿素含量，另一方面来源于人为的尿素或者牛尿掺假。研究表明，原料乳中尿素的正常生理浓度通常情况下应介于30～36mg/100mL[4]之间，若超过40mg/100mL则视为高脲乳或不合格牛乳[5]。人体血脲正常参考范围为 2.8～8.2mmol/L(17～49mg/100mL)[6]。但尿素掺假或者病理性高脲乳的尿素浓度则远远超过这个上限，可见，开发一种简单快速的区别检测方法对高脲乳进行筛检是非常必要的。

鉴于本研究推出的快速检测试纸条可能进入家庭使用，因此有必要考虑检测结果对使用者饮食心理的影响，没必要甚至不能指示出正常生理范围内存在的尿素而造成某些人群的饮食压力甚至导致厌食后果，这样则希望检测方法的灵敏度不要太高，能满足检测要求便可。但符合这样要求的人性化检测方法尚未见报道。

早期报道的乳脲含量测定方法很多[7-8]，其中也不乏用于尿素掺假乳的检测，但这些研究几乎都追求高度的检测敏感度，但因乳品的不透明性和脂肪含量不稳定性等，目前还未形成一种为大家共同接受的方法[3,8]。此外这些测定多采用传感器对尿素经酶解产生的铵根或二氧化碳进行定量测定[9-10]需要借用复杂的仪器设备，也不可能开发为便携式现场快速检测方法。尿素在脲酶的催化下释放出氨和二氧化碳，导致pH值升高，而升高的ΔpH值与体系尿素含量呈正相关。而不同的酸碱指示剂具有不同的pKHIn值，会在不同的pH值处变色。依此可以选择合适的酸碱指示剂使其能够在合适的尿素浓度处变色，也可以通过调整起始pH值达到相同目的。

前期有研究[11]将脲酶固定于试纸上制成检测试纸的思路对本实验很有启发。本研究目的是在前人研究基础上，以消除本底脲的鲜乳为材料，实现乳脲真实含量的定量测定，筛选合适的酸碱指示剂，优化起始pH值条件，开发用于高脲乳检测的简单便携式检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

生鲜牛乳由合作企业提供，实验用脲酶以刀豆(jack bean)磨成细粉替代，刀豆购于种子公司，无特殊要求；标准脲酶(urease，EC：3.5.1.5) 美国Sigma公司。

1U/mL的脲酶母液(纯水配制，商品脲酶比活为33 U/mg)和质量浓度为1g/mL尿素溶液母液；质量浓度为1g/L的指示剂溶液用体积分数为20%的乙醇溶液配制。

标准型PB-10 pH计 德国赛多利斯公司。

1.2 方法

1.2.1 尿素检测试纸制作

由于脲酶抑制剂种类多样，常因缓冲液的使用而失活，如磷酸盐缓冲液的抑制[12-13]，因此有人主张脲酶使用中采用无缓冲液的体系[14-15]，实验也证明，脲酶在无缓冲液体系中具有正常的催化活性，因此本实验采用无缓冲体系进行刀豆粉末的配制。首先将刀豆磨粉过120目筛获得细粉末，将其分别加入1mg/mL的苯酚红和溴百里酚蓝溶液中使刀豆粉末质量浓度为2g/100mL，即为含有指示剂的脲酶溶液。将普通的定量滤纸置于脲酶溶液中浸泡，反转使试剂均匀附着在试纸两面，用镊子夹起纸片一端，沥去多余汁液，悬挂阴干，即成尿素检测试纸。试纸可以用手接触像pH试纸一样使用；也可裁成小片、固定在较硬载体上，接上手柄成检测试纸条。

1.2.2 乳本底脲清零

按照5U/L的添加量，给鲜乳中加入商品脲酶，50℃水浴温育降解乳中本底脲，同时用pH计监测鲜乳pH值变化，在pH值开始上升并恒定不变后说明尿素不再水解，继续延长10min，使乳中本底脲水解完全，称为“消脲乳”。沸水浴30min灭活脲酶[16]，同时挥去乳液中的气体。用HCl溶液调节消脲乳起始pH值，并用其制备标准浓度尿素的乳液，使尿素的质量浓度范围为0～100mg/100mL，用于指示剂和起始pH值优化条件的筛选。

1.2.3 牛乳起始pH值的调整与优化

由于本方法原理基于pH值变化，而正常鲜乳的pH值范围介于6.3～6.8，数据随样品而异，本法制备的消脲乳，其pH值更高，常常达到pH8以上。为了保证检测准确性和不同批次牛乳检测结果的可比性，本方法要求在检测之前调整牛乳起始pH值达到统一标准。另一方面，检测起始pH值越高，同一指示剂变色所需要的尿素量就越少，反之亦然，因此可通过起始pH值调整，优化指示剂的显色范围。考虑脲酶活性范围(pH6～8)，起始pH值调节不应超出此范围。不同起始pH值的标准乳脲液配制方法：首先用水配制尿素母液，并调节其pH值为7.0。再取较大量消脲乳调节其pH值，并用此pH值的消脲乳稀释中性尿素母液，则成为相应pH值条件下系列浓度的标准乳脲液。实验分别制备了6组pH6.5～7.0之间的标准乳脲液，每组pH值相差0.1个pH值单位，用于起始pH值的优化实验。

1.2.4 指示剂的选择

考虑牛乳对颜色变化的遮盖作用，所选指示剂在变色前后的颜色对比度要尽可能大。考虑脲酶最适pH值为6～8，指示剂pKHIn不应超过pH8。符合该条件的常见指示剂为中性红、溴百里酚蓝和苯酚红，其性质列于表1，鉴于中性红变色前后为红-黄橙难以辨认，因此选用溴百里酚蓝和苯酚红作为候选指示剂。

表1 实验相关候选指示剂Table 1 Relevant acid-base indicators

1.2.5 检测条件的优化与加样方法

取含有苯酚红和溴百里酚蓝的脲酶试纸给其上滴加起始pH值不同的、已知质量浓度的含脲乳液，观察颜色变化，比较不同指示剂试纸在不同起始pH值条件下颜色变化，选择正好能在40～50mg/100mL乳脲范围内变色的指示剂和起始pH值。

为了降低牛乳对颜色变化的遮盖作用，实验室中加样采用在试纸一旁滴加乳液一滴，令其靠试纸的毛细作用渗透吸收乳液，湿润试纸即可。若制备成带有手柄的试纸条，则可采用在检测窗口加样湿润试纸后，立即甩去窗口上的多余乳液，待其显色。实践证明十分方便并有效。

1.2.6 比色卡制作与试剂盒的组装

以实验室制备消脲乳配制的标准尿素质量浓度乳液为参比，采用其含量为0(阴性对照)、40mg/100mL (牛乳生理上限)和50mg/100mL(人血脲氮上限)标准含脲乳，在显色最适pH值条件下的显色深度作为颜色卡切标准，采集其颜色制备成比色卡。样品检测结果可以跟比色卡对比，以判定MUN是否超过40mg/100mL和50mg/100mL这2个卡切值。

按照优化后的检测方案组装试剂盒，组分包括：配有比色卡的溴百里酚蓝脲酶试纸条若干，含0.1mol/L叠氮化钠防腐剂的消脲乳(阴性对照)1瓶，调节牛乳起始pH值用0.5mol/L盐酸和氢氧化钠溶液各1瓶。视需要配备滴管和小烧杯，一次性配备pH计1台。

试剂盒使用方法为：1)取待检样于小烧杯中，使用pH计精确调节样品pH值至6.8；2)取检测试纸2张，分别在其窗口上滴加一滴阴性对照和调好pH值的待检样，2～3s试纸吸饱水分后，甩去奶液，等待颜色稳定、显色完全；3)与比色卡进行对照，判定被检样的MUN含量范围。

2 结果与分析

2.1 酶解法制备消脲乳及其意义

由于乳脲含量日间差异很大，不同来源不同批次的生鲜乳，含尿素的量也各不相同，按照现有实验方法[8]，给标准含脲乳体系的建立带来很大麻烦。

本实验采用脲酶降解法消除本底乳脲再采用沸水浴灭活脲酶。对脲酶处理过的乳液采用参文描述方法[6]，未测到有尿素存在。证明尿素彻底被水解，成功制备了尿素含量为零的“消脲乳”。借此可配制任意已知浓度的乳脲液，大大方便了实验的进行。

2.2 牛乳缓冲性能及其对检测结果的影响分析

研究报道[3]牛乳在pH5.3～5.4狭窄范围内具有较大缓冲容量(也称缓冲指数，定义为使1mL牛乳的pH值改变1个单位所须加入的强碱或强酸物质的毫摩尔数)，而在其他pH值范围，牛乳的缓冲容量很低且相当，因此采用酸碱调节牛乳pH值是有效的，不同样品调整的pH值是可比的。依此，本检测中，只要所优化的起始pH值不在pH5.3～5.4范围内，本检测方法预调起始pH值的结果就是可信的，不会影响检测结果，也基于此依据，借用强酸碱调节乳品pH值进行的相关研究报道屡见不鲜[17-18]，也才有不少基于脲酶催化尿素检测pH值变化的研究思路[11,19]。

2.3 不同质量浓度乳脲使2种指示剂在起始pH6.5条件下的变色结果

用起始pH6.5的标准乳脲液检测了2种指示剂的脲酶试纸的变色情况，用不同批次的脲酶试纸平行检测3次以上。变色结果如图1所示。

图1 起始pH6.5时2种脲酶试纸变色的3组结果Fig.1 Color development of two types of urease-test-strips at initial pH 6.5 in triple parallel experiments

从图1两种试纸的分别3次的实验结果可见，2种指示剂变色现象不同。苯酚红试纸的变色特点是，从理论上的黄色向红色变化过程中，出现了缓慢过渡的橙色，从显色结果估计其变色的M U N范围为20～40mg/100mL，但变色点难以辨认，不符合检测要求，因此放弃对苯酚红指示剂显色条件的继续优化。而溴百里酚蓝试纸变色点明显，直接从棕黄色变成蓝绿色，容易辨别。因此选定溴百里酚蓝作指示剂继续优化。在起始pH6.5条件下，溴百里酚蓝试纸变色点在MUN 70mg/100mL，需通过提高起始pH值来矫正变色时的MUN浓度，使其显色点降低到MUN 40～50mg/100mL范围。

2.4 溴百里酚蓝脲酶试纸检测起始pH值条件的优化

图2 不同起始pH值条件下溴百里酚蓝试纸变色点处的MUN质量浓度Fig.2 Color development of BTB-UTP at different initial pH. BTBUTP: bromothymol blue-urease test paper

按照1.2.3节实验方法配制不同pH值的标准乳脲液，用溴百里酚蓝脲酶试纸对其进行检测，显色结果如图2所示。可见在不同起始pH值条件下，该试纸的变色点是不同的。调整的起始pH值越低，显色点处的MUN质量浓度越高，反之亦然。当起始pH值在6.8时，溴百里酚蓝脲酶试纸的变色点位于乳脲氮生理上限卡切值40mg/100mL附近，满足检测要求。

该实验结果也说明，由乳脲引起的pH值变化只是一个小范围的pH值改变，起始pH值对检测结果起着决定性作用，因此要求用精密pH计进行准确调节。

2.5 起始pH6.8时溴百里酚蓝脲酶试纸的显色效果及稳定性

采用3个不同批次制备的溴百里酚蓝脲酶检测试纸对pH6.8条件下的标准乳脲液进行测定，表明显色效果十分稳定，结果如图3所示。

图3 起始pH6.8时溴百里酚蓝脲酶试纸变色的3组结果Fig.3 Color development of BTB-UTP at optimal initial pH 6.8 by triple parallel experiments. BTB-UTP: bromothymol blue-urease test paper

从图3可见，MUN含量低于40mg/100mL者，其显色棕黄色，接近阴性对照，而当MUN含量高于40mg/100mL时显色为蓝绿色，且随着MUN含量的升高，蓝绿色颜色加深。MUN含量等于40mg/100mL时，显色介于过度状态。实验表明其再现性良好。因此所优化的条件和方法可以指示MUN超生理上限的高脲乳或者尿素掺假乳。

2.6 比色卡和试剂盒及其对市售几种品牌鲜乳的检测

图4 按照比色卡对市售不同品牌牛乳的检测结果Fig.4 Color chart and test results of market-available milk from 6 kinds of brands

采用实验室标准MUN的显色结果，制备包括0、40、50mg/100mL三个卡切值的比色卡如图4a。按照比色卡颜色深度，凡是显色深度浅于40mg/100mL的样品均可视为正常乳品；颜色深度超过40mg/100mL标准色卡的，均可判定为尿素超标乳；若颜色深度超过50mg/100mL标准色卡者，此时尿素含量已超过人体内血脲氮含量上限，不建议饮用。

用自制的溴百里酚蓝-脲酶试纸条，以消脲乳作阴性对照，取市售6种不同品牌的牛乳各1袋，分为2份，随机编号，采用单盲法对2份6个牛乳分别用制备的试纸条和试纸小片进行了MUN含量估计，检测结果如图4 b所示。

图4b检测结果显示，6个鲜乳样品的检测显色结果是各不相同的，说明试剂盒能够区别检测不同样品；2组检测结果几乎完全一致，说明检测试纸条和试纸片具有同样的适用性，且重复性良好；在检测的6个鲜乳样品中，只有2个样品(S1、S2)的乳脲含量低于正常上限卡切值40mg/100mL，而其他4个样品(S3～S6)MUN含量都高于上限卡切值，其中2个还高于人血脲氮水平50mg/100mL。可见市售鲜乳尿素超标普遍，值得给与重视和关注。

3 结 论

3.1 采用脲酶对牛乳中的本底脲进行消除再对脲酶进行灭活，可以制备乳脲含量为零的消脲乳，大大方便了实验研究，解决了乳脲测定研究中难以取得空白对照的困难。

3.2 在几种常见指示剂中，溴百里酚蓝的酸碱色差大，满足实验要求。对牛乳起始pH值进行优化，当起始pH值被调整为6.8的时候，溴百里酚蓝正好在乳脲上限卡切值(40mg/100mL)处变色。

3.3 按照标准浓度的乳脲浓度显色结果制备了标准比色卡；研究形成了便携式快速检测高脲乳的方法，可以组装成尿素检测试剂盒，试剂盒可方便应用于实践检测中。

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Rapid Detection Method for High-Urea Milk Based on Urease Catalysis

YANG Shui-yun，ZHENG Xiao，HAN Yu，LONG Yong-qiu，LIU Yong-qing
(Key Laboratory of Biomedical Information Engineering, Ministry of Education, Institute of Mitochondrial Biology and Medicine,School of Life Science and Technology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049, China)

The objective of this study is to establish a rapid detection method for milk with urea content exceeding physiological range. Based on the fact that pH increase could result from urea enzymolysis positively correlated with urea concentration.Bromothymol blue was chosen as the acid-base indicator to determine high-urea milk. The indicator can develop color from yellow-brown to green-blue when urea content was higher than 40 mg/100 mL. On the basis of our present study, the developed reagent kit for the determination of high-urea milk is useful for practical application.

adulterated milk；pathological high-urea milk；test paper；milk-urea reagent kit；urease；milk urea nitrogen

TS201.6

A

1002-6630(2011)10-0222-05

2010-08-11

杨水云(1962—)，女，副教授，博士，研究方向为分子生物学技术和食品安全监测技术。E-mail：shyyang@mail.xjtu.edu.cn