卡亚多酚定性定量分析及提取工艺优化

俞彦波，江 婷，周才琼*

(西南大学食品科学学院，重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400716)

卡亚多酚定性定量分析及提取工艺优化

俞彦波，江 婷，周才琼*

(西南大学食品科学学院，重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400716)

以引种栽培的新食物资源——卡亚为原料，对其多酚类进行定性定量分析，并以总多酚得率为目标，进行提取工艺优化研究。结果表明，卡亚含有鞣质、多酚和黄酮类物质，100g卡亚鲜叶含单宁0.49g、黄酮类1.29g以及酚类2.57g。通过单因素及正交试验优化提取工艺，确定卡亚酚类物质提取的最佳条件为料液比1:15(g/mL)、温度60℃、提取时间3h、超声辅助提取时间20min，100g卡亚鲜样优化提取多酚得率最高为408mg。

新食物资源；卡亚；多酚；提取工艺

卡亚(Cnidoscolus spp.)为大戟科(Euphorbiaceae)叶茂盛的多年生灌木，是玛雅印第安人“理想的食物和医药”。其广泛的生物活性包括血液循环、助消化、改进视力、血管痔疮消炎、降胆固醇、减肥、止咳、骨骼增钙、预防贫血、增强记忆、健脑、治疗关节炎与糖尿病等[1]。有报道卡亚活性成分包括黄酮甙类和三萜类等[2]，Kuti等[3]报道卡亚富含多种酚类化合物和黄酮物质，是天然抗氧化剂的良好食品来源。为扩展食物新资源——卡亚的应用，本实验拟对引种至重庆栽培的卡亚所含多酚类物质采用单因素和正交试验，以期提高卡亚多酚的提取率，并对部分多酚进行定性定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卡亚鲜叶 西南大学农业综合开发研究室试验田。

无水碳酸钠、三氯化铁、钼酸钠、钨酸钠、磷酸、铁氢化钾、浓盐酸、95%乙醇、氯化钠、明胶、镁粉等(均为分析纯)；芦丁标准品 天津一方科技有限公司。

1.2 设备与仪器

722分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；FZ102型微型植物粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；旋转蒸发器RE-52A 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 材料预处理

将新鲜卡亚叶片于50℃鼓风干燥箱烘干(水分含量10%以下)，植物微型粉碎机打碎，过40目筛。取粉粹样品10g，加10倍量95%乙醇，沸水浴回流提取1h，过滤，滤液备用。

1.3.2 酚类和鞣质定性分析

取1.3.1节醇提液1mL，加入1%三氯化铁乙醇溶液2～3滴，如有酚类存在时应产生绿、蓝或暗紫色反应，水样鞣质显蓝黑色并有沉淀产生，缩合鞣质显墨黑色沉淀。取醇提取液1mL，加入明胶-氯化钠溶液，如有鞣质存在则产生沉淀。取醇提液1滴于滤纸上，喷洒三氯化铁-铁氢化钾试剂(2%三氯化铁水溶+1%铁氢化钾水溶液)，如有酚类存在产生蓝色斑。盐酸-镁粉实验检测黄酮类。

1.3.3 部分酚类物质定量分析

总黄酮含量测定采用亚硝酸钠-硝酸铝法[4]；多酚含量测定采用Folin-ciocalteu法[5]。

1.3.4 卡亚多酚类物质提取工艺优化

以不同乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度和超声辅助提取时间进行单因素试验。

根据单因素试验结果，将料液比、提取时间、温度和超声波辅助时间作为因素，设置L9(34)正交试验，对卡亚多酚提取得率条件进行优化。

1.3.5 Folin-ciocalteu试剂法[6]测定酚类物质

1)Folin-ciocalteu试剂的制备：在500mL磨口回流装置内，加入20g钨酸钠、5g钼酸钠、70mL去离子水，再加入10mL 85%磷酸及20mL浓盐酸，充分混匀后，以小火回流10h，再加入30g硫酸锂，10mL去离子水及数滴液溴，然后开口继续沸腾15min，以便去除过量的溴。冷却后，定容至200mL，置棕色瓶中保存于冰箱。使用时以1体积水加1体积试剂稀释。

2)标准曲线的绘制：称取0.1g没食子酸，定容至100mL，吸取上述溶液1mL，定容至50mL，使溶液质量浓度0.02mg/mL，分别取0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL没食子酸标准溶液与1mL Folin-Ciocalteu试剂反应，混匀，加入15% Na2CO3溶液3mL，加去离子水补足体积至10mL。室温静置40min，测其在波长765nm处的吸光度，以没食子酸质量浓度为横坐标、A765nm为纵坐标做标准曲线。

3)样品的测定：根据标准曲线制定的步骤测定，从标准曲线上计算相应的多酚类物质含量。

Folin-Ciocalteu法制作没食子酸标准曲线。根据吸光度与质量浓度做标准曲线，得其线性方程为y=0.0164x－0.0214(R2=0.999)。

2 结果与分析

2.1 卡亚酚类物质的定性定量分析

表1显示卡亚叶含有鞣质和酚类物质。经定量分析显示100g卡亚鲜叶含单宁0.49g、黄酮类1.29g以及酚类2.57g。

表1 卡亚叶酚类物质初步定性分析结果Table 1 Results of qualitative analysis for phenols in Chaya leaves

2.2 卡亚酚类物质提取单因素试验[7]

多酚在水溶液中有良好的溶解性，但由于多酚在植物中常与多糖、蛋白质等以氢键和疏水键形成稳定的复合物，所以选择多酚提取溶剂时除了要求溶剂对多酚有很好的溶解性外，还必须有断裂氢键的作用。所有水与有机溶剂的复配体系较适合多酚提取，考虑到成本和毒性问题，选择乙醇与水进行复配作为提取溶剂。

2.2.1 乙醇体积分数对酚类物质提取的影响

在料液比1:15(g/mL)条件下，分别采用体积分数0%、20%、40%、60%、80%的乙醇溶液50℃恒温提取2h，结果见图1。酚类物质提取量随乙醇体积分数增大而呈下降趋势，100g鲜样所得总酚量从470mg下降至310mg。考虑到水溶液提取浓缩较困难，后续正交优化试验选用20%乙醇溶液进行实验。

图1 乙醇体积分数对酚类提取的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction rate of phenols in Chaya leaves

2.2.2 提取时间对酚类物质提取的影响

图2 提取时间对酚类物质提取的影响Fig.2 Effects of extraction time on extraction rate of phenols in Chaya leaves

采用20%乙醇体积分数，料液比1:15条件下，分别在50℃恒温提取1、2、3、4、5h，卡亚酚类物质得率见图2。随提取时间延长，酚类物质的提取效果出现先增后减的趋势，在3h达到最高峰为382mg。

2.2.3 提取温度对酚类物质提取的影响

在乙醇体积分数20%，料液比1:15条件下，分别在30、40、50、60、70℃对卡亚提取3h，多酚得率见图3。随提取温度升高，酚类物质提取量呈先升后降的趋势，在50℃时酚类物质得率最高达366mg。

图3 提取温度对酚类物质提取的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction rate of phenols in Chaya leaves

2.2.4 料液比对酚类物质提取的影响

采用20%乙醇体积分数，分别在1:5、1:10、1:15、1:20、1:25料液比的条件下50℃提取2h，测定料液比对卡亚酚类物质提取效果的影响。结果见图4，随料液比提高，酚类物质得率逐渐增加，但当料液比超过1:15后，酚类得率增加趋势变缓。考虑后续浓缩及成本问题，选择1:15左右的料液比例对酚类物质进行优化提取。

图4 料液比对酚类物质提取效果的影响Fig.4 Effects of material/liquid ratio on extraction rate of phenols in Chaya leaves

2.2.5 超声辅助提取对酚类物质提取的影响

采用20%乙醇体积分数，料液比1:15，在50℃提取3h，分别设置超声辅助提取时间为10、20、30、40、60min，结果见图5。随着超声处理时间延长，酚类提取效果呈先升后降趋势，在超声处理30min时多酚最高达412mg。

图5 超声辅助时间对酚类物质提取的影响Fig.5 Effects of ultrasonic treatment time on extraction rate of phenols in Chaya leaves

2.3 卡亚多酚类提取条件优化试验

在单因素试验基础上设计4因素3水平正交试验，各因素水平设计和试验结果见表2，在所选4个因素中，影响卡亚酚类得率的因素依次为A＞B＞D＞C，即提取时间＞料液比＞超声辅助提取时间＞提取温度。提取卡亚酚类化合物的最佳组合为A2B2C3D1，即提取时间3h、料液比1:15、温度60℃、超声辅助提取20min，此时100g鲜样进行提取所得多酚可达408mg。

表2 卡亚多酚类提取条件正交试验设计与结果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental results

3 讨论与结论

多酚类化合物是指其分子结构中有若干个酚性羟基的植物成分的总称。都具有一定的抗氧化能力，是优良的氢活中子的给予体，能对引起生物组织因产生过氧化作用而代之结构和功能损伤的一些自由基有明显的清除能力[8]。

经对卡亚酚类物质进行定性分析，卡亚含有酚类包括鞣质和黄酮类。卡亚多酚类化合物的提取结果表明，影响卡亚酚类得率的因素按大小排序为A＞B＞D＞C，即提取时间＞料液比＞超声辅助提取时间＞提取温度。卡亚多酚类物质提取的最佳溶剂为20%乙醇溶液、提取温度60℃、提取时间3h、料液比1:15(g/mL)、超声辅助提取时间20min。

多酚类物质极性较大，易溶于极性溶剂，可采用丙酮、甲醇、乙醇、水等极性溶剂提取，但是，综合毒性、成本、提取率等多种因素，本实验采用乙醇-水混合体系提取，乙醇体积分数增大但是多酚提取率却下降，可能是由于溶剂与多酚极性的相似程度降低导致。也可能是因为高体积分数的乙醇可引起组织中蛋白质变性，特别是当乙醇体积分数过高时，阻止多酚类物质的渗出，影响多酚物质的提取得率。同时，高体积分数的乙醇溶液提取物含有较多的色素和亲脂性强的成分，这些成分与多酚化合物竞争乙醇-水分子结合，还可导致多酚得提取得率下降[9]。

[1] ANDRADE-CETTO A, HEINRICH M. Mexican plants with hypoglycaemic effect used in the treatment of diabetes[J]. J of Ethnopharmacology, 2005, 99 (3): 325-348.

[2] ESCALANTE-EROSA F, RTEGN-CAMPOS I, PARRA-TABLA V,et al. Chemical composition of the Epicuticular Wax of Cnidoscolus aconitifolius[J]. Rev Soc Quím Méx, 2004, 48: 24-25.

[3] KUTI J O, KONURU H B. Antioxidant capacity and phenolic content in leaf extracts of tree spinach (Cnidoscolus spp.)[J]. J Agric Food Chem,2004, 52(1): 117-121.

[4] 孙敏耀, 唐文照, 卢霞, 等. 分光光度法测定不同采收时间桑叶中总黄酮[J]. 中草药, 2004, 35(10): 1189-1190.

[5] 李玲玲. 苹果酚类物质及其抗氧化活性研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2006.

[6] 李国秀, 李建科. 石榴皮中多酚物质的提取工艺研究[J]. 陕西农业科学, 2010(3): 20-21.

[7] 梁清蓉. 番石榴叶中酚类物质的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2005.

[8] 马利华. 漂烫处理对牛蒡多酚提取及体外抗氧化性影响[J]. 食品工业科技, 2010(6): 121-124.

[9] 石碧, 狄莹. 植物多酚[M]. 北京: 科学出版社, 2000.

Extraction Optimization and Composition Identification of Polyphenols in Chaya

YU Yan-bo，JIANG Ting，ZHOU Cai-qiong*
(Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, College Food Science, Southwest University,Chongqing 400716, China)

A new food resource, chaya was qualitatively and quantitatively analyzed for its polyphenol components. The extraction of polyphenols from the food resource was optimized based on total polyphenol extraction rate. The results indicated that chaya contained tannins, polyphenols and flavonoids, which were 0.49, 2.57 g and 1.29 g in 100 g of fresh chaya leaves,respectively. The optimal extraction conditions for chaya polyphenols that were determined by single-factor and orthogonal array design were: material/liquid ratio of 1:15, extraction temperature of 60 ℃, extraction time of 3 h and ultrasonic treatment time 20 min. Under the condtions, 408 mg of polyphenols was extracted from 100 g of fresh chaya.

new food resources；Chaya；polyphenol；extraction process

R284.2

A

1002-6630(2011)10-0084-04

2010-08-11

西南大学博士基金项目(SWUB2008015)

俞彦波(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：yuyanbo1984@163.com

*通信作者：周才琼(1964—)，女，教授，博士，研究方向为食品营养化学。E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn