南美白对虾中4种病原菌的多重PCR检测

郭倩倩，陶 妍*，谢 晶

(上海海洋大学食品学院，上海 201306)

南美白对虾中4种病原菌的多重PCR检测

郭倩倩，陶 妍*，谢 晶

(上海海洋大学食品学院，上海 201306)

根据沙门氏菌的侵染上皮细胞表面蛋白基因(invA)、单增李斯特菌的侵入关联蛋白基因(iap)、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)和副溶血性弧菌的耐热直接溶血素基因(tdh)分别设计4对特异性引物，并以细菌16S rRNA基因的部分保守序列为内标，通过对退火温度、引物浓度等反应参数的调整和优化，建立的多重PCR方法为10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、dNTP 200μmol/L、DNA模板1μL、Taq DNA聚合酶2.5U，引物浓度分别为16S rRNA 200nmol/L、tdh 250nmol/L、nuc 300nmol/L、iap 350nmol/L、invA 250nmol/L，加无菌水至总体积为20 μL；反应条件：94℃预变性4min、94℃变性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min，反应共进行30个循环。为检验该方法的可行性，进一步对人工接种上述4种病原菌的南美白对虾进行多重PCR检测。结果表明：对污染样品直接提取DNA和预增菌后提取DNA再进行多重PCR检测，均能有效扩增出各个目的片段；但预增菌处理后可使检测限明显降低，进而大大提高检测的灵敏度。本多重PCR方法可作为食品包括水产品中病原微生物的快速、灵敏和高效的检测方法。

多重PCR；沙门氏菌；单增李斯特菌；金黄色葡萄球菌；副溶血性弧菌

众所周知，传统的微生物鉴定方法需分离培养、生化反应和血清学鉴定等多个步骤，操作复杂、周期长，不利于病原菌的快速检测。近十年来，生物技术的发展为建立新型、快速、灵敏的病原微生物检测方法提供了可能。例如，聚合酶链式反应，即P C R(polymerase chain reaction)技术，它是一种对特定DNA片段在体外进行快速扩增的技术。自1988年Chamberlian等[1]首次提出这一概念以来，该技术已被逐步应用于核酸诊断的多个领域，特别是病原微生物的检测方面。国内许一平等[2]报道了对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测方法，但未用于实际样品的测定；曾海燕等[3]建立了三重PCR体系用于鉴别消毒奶及其加工环境中的李斯特菌属的几种菌；2009年，遇晓杰等[4]报道了对生畜禽肉中沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和蜡样芽胞杆菌进行多重PCR检测的方法。国外Jofre等[5]报道了应用多重PCR技术同时检测火腿肠中的单增李斯特菌和沙门氏菌；Germini等[6]对鸡蛋中的大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和单增李斯特菌进行了多重PCR检测。

水产品因其含水量高、营养成分丰富，易受多种微生物污染，致使其检测背景复杂，故迄今为止，关于多重PCR技术应用于水产品中病原微生物检测的报道较少。近来，报道了对文蛤(Meretrix meretrix)中副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的三重PCR检测方法[7]，但未考察样品前处理方法对检测结果的影响。本实验在上述研究的基础上，以沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌表达的特异性蛋白的编码基因为基础，设计4对特异性引物，以16S rRNA基因为内标，建立多重PCR的优化方法；并以人工接种这些病原菌的南美白对虾(Penaeus vannamei)为检测对象，对其应用效果进行评价；另外，比较被检样品未增菌和预增菌处理后对检测灵敏度的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

共6株实验菌，其中金黄色葡萄球菌购自上海市工业微生物研究所；沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)为本实验室保藏的菌种；前4种菌为试验菌，后两种菌在引物特异性考察时使用。

营养肉汤培养基、细菌DNA提取试剂盒、PCR试剂、DNA Marker、6×Loadding Buffer、琼脂糖等由天根生化科技有限公司提供。

1.2 细菌总DNA提取和引物设计

将上述6个菌种分别接种于营养肉汤中，37℃摇床培养过夜；离心收集菌体后，采用细菌DNA提取试剂盒对各种菌的基因组DNA进行提取。

分别根据沙门氏菌的侵染上皮细胞表面蛋白基因(invA)、单增李斯特菌的侵入关联蛋白基因(iap)、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)、副溶血性弧菌的耐热直接溶血素基因(tdh)设计4对特异性引物，以细菌16S rRNA基因的部分保守序列为内标(表1)。

1.3 引物特异性的考察

为考察所设计的引物是否准确和具特异性，先分别以沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的基因组DNA为模板，进行单重PCR扩增，反应体系为：10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、DNA模板1μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL；Taq DNA聚合酶0.5μL，加无菌水至总体积20μL。反应条件：94℃预变性4min、94℃变性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min，反应共进行30个循环。然后，以6种菌基因组DNA的混合物为模板，分别使用上述与每种试验菌相关的一对引物进行单重PCR，以期考察所设计引物的特异性。

1.4 多重PCR体系的优化

将4种试验菌的基因组DNA混合物作为模板，使用相应的4对引物进行多重PCR。先采用如下的PCR体系：10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、DNA模板1μL、10μmol/L的各种试验菌上下游引物0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，加无菌水至总体积20μL。反应条件：94℃预变性4min、94℃变性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min，反应共进行30个循环。在上述反应体系和条件下，分别对退火温度、引物浓度、DNA模板浓度等因素进行优化。

表1 引物名称及序列Table 1 Names and sequences of primers

1.5 人工污染样品的制备及PCR检测

市售新鲜的南美白对虾在无菌条件下剥壳、均质后，用作菌污染的对象。将沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌分别接种于营养肉汤中，37℃摇床培养过夜；取1mL菌液与9mL的生理盐水混匀，10倍倍比稀释，进行平板计数，按下列方法操作：

①每种试验菌取108～103CFU/mL共6个浓度，每个浓度的菌液取1mL接种至含10g碎虾肉的90mL生理盐水或营养肉汤中，立即提取DNA或37℃摇床培养16h后提取DNA进行PCR检测。

②将4种试验菌的浓度分别调至108CFU/mL，混合均匀后，按10倍倍比稀释至108～103CFU/mL，每个浓度的混合菌液取1mL接种至含10g碎虾肉的90mL生理盐水或营养肉汤中，立即提取DNA或37℃摇床培养16h后提取DNA进行PCR检测。

2 结果与分析

2.1 引物特异性的考察

图1 4种试验菌的单重PCR结果Fig.1 Singleplex PCR detection results of 4 pathogens

如图1所示，先分别以各个试验菌的基因组DNA为模板，加入各自的特异性引物进行PCR扩增，分别获得来自沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的984、763、484bp和202bp的特异性谱带，其分子大小均符合各个毒素蛋白编码基因的预期扩增结果。

将4种试验菌及大肠杆菌O157:H7和蜡样芽孢杆菌的基因组DNA等量混合后作为模板，分别加入来自沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的各对引物，进行单重PCR，结果如图2所示，各对引物只能扩增出一个片段，证明所设计的引物具有很好的特异性。

图2 引物特异性的考察结果Fig.2 Specificity of the primers designed

2.2 多重PCR体系的优化

首先，以各个试验菌的基因组DNA为模板，分别加入相同浓度的各对特异性引物和16S rRNA引物，进行二重PCR，分别成功扩增到预期分子大小的各个特异性片段和内标16S rRNA的95bp的片段(图3，泳道2～5)；然后，以4种试验菌的混合DNA为模板，对各对引物浓度进行调整后，进行多重PCR，结果显示4种试验菌及16S rRNA的目的片段均得到有效扩增(图3，泳道1)。

图3 4种试验菌的二重及多重PCR结果Fig.3 Detection of 4 pathogens by diplex and multiplex PCR

影响多重PCR的因素较多，且每个因素对PCR的影响程度不同，本实验主要对退火温度、引物浓度及其他因素诸如dNTP浓度、缓冲液用量、模板浓度和延伸时间等进行筛选和优化。由于退火温度对PCR的影响最大，首先加入等量各对引物，在其他条件不变的情况下，分别采用55～59℃的退火温度进行多重PCR，结果如图4所示。在退火温度为56、57、58℃时，来自4个试验菌和一个内标的共5个目的片段均得到有效的扩增；因为在后续的实验中发现，57℃的扩增稳定性要高于56℃和58℃，因此选择57℃为最佳退火温度。在57℃的退火温度时，其他条件不变，根据谱带的明暗程度，分别增加或者减小各对引物的浓度，使各个目的片段达到最佳的扩增效果。由图5A可见，泳道2和3的各个谱带显示了最佳的扩增效果，最终确定各对引物的浓度分别为16S rRNA 200nmol/L、tdh 250nmol/L、nuc 300nmol/L、iap 350nmol/L、invA 250nmol/L。此外，在对其他因素的优化过程中，发现dNTP浓度、模板浓度和延伸时间等对PCR结果均没有明显的影响，仅缓冲液用量显示2.0μL较其他用量具有更好的扩增效果(图 5B)。

图4 不同退火温度条件下的多重PCR结果Fig.4 Multiplex PCR detection at different annealing temperatures

图5 引物浓度(A)和缓冲液用量(B)的优化结果Fig.5 Optimization of primer concentration (A) and buffer quantity (B)

2.3 对人工接种病原菌的南美白对虾的检测

2.3.1 单重PCR检测

图6 未经预增菌条件下南美白对虾中沙门氏菌(A)和副溶血性弧菌(B)的单重PCR检测结果Fig.6 Singleplex PCR detection of non-enriched Penaeus vannamei sample inoculated with Salmonella (A) and V.parahaemolyticus (B)

图7 预增菌条件下南美白对虾中沙门氏菌(A)和副溶血性弧菌(B)的单重PCR检测结果Fig.7 Singleplex PCR detection of enriched Penaeus vannamei sample inoculated with Salmonella (A) and V. parahaemolyticus (B)

首先，采用各个单一试验菌接种10g碎虾肉后，直接提取污染样品的基因组DNA进行单重PCR检测，结果显示，各个菌的最低检测限分别为沙门氏菌102CFU/mL(图6A)、副溶血性弧菌103CFU/mL(图6B)；单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌均为103CFU/mL(结果未显示)；另一方面，对人工接种病原菌的样品，经过16h预增菌后再提取基因组DNA进行单重PCR检测，结果显示，沙门氏菌(图7A)和副溶血性弧菌(图7B)的最低检测限均为101CFU/mL；单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌亦均为101CFU/mL(结果未显示)，证明对被检样品进行预增菌可明显降低检测限。

2.3.2 多重PCR检测

首先，将同浓度的4种试验菌混合均匀后，稀释至各个浓度梯度，接种10g碎虾肉后直接提取污染样品的基因组DNA，采用上述优化的方法进行多重PCR检测，检测限为104CFU/mL(图8A)；另一方面，对接种后的样品经过16h预增菌后再提取基因组DNA进行多重PCR检测，检测限明显下降至101CFU/mL(图8B)。

图8 未经预增菌(A)和预增菌(B)条件下南美白对虾中4种病原菌的多重PCR检测结果Fig.8 Multiplex PCR detection of non-enriched (A) and enriched (B)Penaeus vannamei samples inoculated with four pathogens

3 结 论

本实验以沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌各自特异表达的毒素蛋白的编码基因为检测目标，设计和筛选了对应于各个毒素蛋白的特异性引物，并确保了各对引物所扩增的片段在分子大小之间的差异，以便于多重PCR检测；另外，16S rRNA基因在本实验中作为一个内标，对PCR系统和反应条件的分析和判断具有非常重要的作用，通过16S rRNA基因的扩增结果，可以对本实验设置的不同反应条件下PCR结果之间的差异进行准确的分析和判断。根据文献[8]报道，在多重PCR中一个片段的扩增会对另一个片段的扩增产生抑止作用，据此，通过调整各对引物之间的浓度差异，使多重PCR结果得到有效的改善。多重PCR中另一个难点是在同时使用多对引物时退火温度之间的差异，本实验在对设计的多对引物进行反复筛选后，最后确定在57℃时，使用4对引物及内标引物均能有效地扩增到各自的目的片段。本实验中缓冲液用量对PCR结果也有一定的影响，而dNTP浓度和模板浓度等影响很小，这些结果与张学敏等[9]的报道是一致的。

在建立多重PCR优化方法的基础上，以人工接种病原菌的南美白对虾为检测对象，考察了直接检测与预增菌后检测的效果。为获得明确和明显的结果，采用了16h的预增菌处理时间。结果表明：16h预增菌后，能显著降低多重PCR的检测限，与Amagliani等[10]的研究结果一致；另一方面，无论在预增菌前接种的菌液浓度如何，在预增菌后，最终的检测限均能达到101CFU/mL，证明食品中病原菌的生长与侵入菌的数量关系不大，而与生长的时间有密切的关系。此外，由于副溶血性弧菌的生长条件比较特殊，用普通肉汤培养基不能使其与其他3种菌同时富集生长，所以采用分别培养的方法可以达到较好的增菌效果。进一步的研究工作将聚焦于荧光定量PCR技术用于水产品致病菌的检测及不同预增菌处理时间对多重PCR检测灵敏度的影响方面。

[1] CHAMBERLAIN J S, GIBBS R A, RANIER J E, et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification[J]. Nucleic Acids Research, 1988, 16(23): 11141-11156.

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Detection of Four Pathogens in Penaeus vannamei by Multiplex PCR

GUO Qian-qian，TAO Yan*，XIE Jing
(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

A multiplex PCR method was presented to detect Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Vibrio parahaemolyticus from Penaeus vannamei, which are main food-borne pathogens. Specific primers were designed according to the invasion protein A gene (invA), invasion associated protein gene (iap), thermo-stable nuclease gene (nuc) and thermo-stable direct hemolysin gene (tdh) from Salmonella, L. monocytogenes, S. aureus and V. parahaemolyticus, respectively. A fragment of conserved sequence of 16S rRNA gene was used as the internal control of amplifiable bacterial DNA. The optimal PCR reaction system was identified as a 20-μL mixture composed of 10 × PCR buffer (+Mg2+) 2.0 μL, dNTP 200 μmol/L, DNA template 1 μ L and Taq DNA polymerase 2.5 U, with primer concentrations of 200 nmol/L for 16S rRNA, 250 nmol/L for tdh, 300 nmol/L for nuc, 350 nmol/L for iap and 250 nmol/L for invA, respectively. One reaction cycle consisted of denaturation at 94 ℃ for 30 s, annealing at 57 ℃for 40 s, and extension at 72 ℃ for 1 min followed by 10 min, and this cycle was repeated 30 times.The method was validated using Penaeus vannamei artificially inoculated with tested pathogens. The results showed that various target DNA fragments could be amplified by the multiplex PCR method in both non-enriched and pre-enriched samples. However, the detection sensitivity was significantly increased by enrichment at 37 ℃. Thus, the multiplex PCR method developed in this study offers an efficient and rapid way for highly sensitive detection of pathogens in aquatic food products.

multiplex PCR；Salmonella；Listeria monocytogenes；Staphylococcus aureus；Vibrio parahaemolyticus

TS201.6

A

1002-6630(2011)10-0148-05

2010-07-11

上海市科委2008年度重点科技项目(08391911500)；2009年上海市优秀学科带头人计划项目(09XD1402000)；上海市教育委员会重点学科建设项目(J50704)

郭倩倩(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：guoqianguo@163.com

*通信作者：陶妍(1961—)，女，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：ytao@shou.edu.cn