高良姜与大高良姜总黄酮抗氧化活性比较研究

王蓓蓓，牛付阁，段玉峰*

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062)

高良姜与大高良姜总黄酮抗氧化活性比较研究

王蓓蓓，牛付阁，段玉峰*

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062)

比较研究高良姜和大高良姜总黄酮的体外抗氧化活性。采用2,2-二苯基-1-苦味酰基(DPPH)自由基体系、超氧阴离子自由基体系、羟自由基体系对高良姜和大高良姜总黄酮的抗氧化活性进行比较研究，并同VC和BHT的抗氧化活性进行比较。在质量浓度 (0.05～0.5mg/mL)范围内，高良姜和大高良姜总黄酮对DPPH自由基、·OH、·的清除率分别为94.0%和94.4%、82.1%和80.7%、16.6%和16.7%，其抗氧化活性微弱于VC和BHT。结果表明，大高良姜中总黄酮的抗氧化活性大于高良姜。

高良姜；大高良姜；总黄酮；抗氧化性

黄酮类化合物(falvonoids)泛指具有15个碳原子的多元酚化合物，广泛存在于自然界，是目前倍受人们关注的天然产物之一。近年来，大量的体内和体外研究表明黄酮类化合物具有较强的抗氧化和清除自由基的活性[1]，同时它们具有抑菌、抗衰老、抗衰变、降血脂、降血压、抗肿瘤、抗炎，调节心血管等的药理保健功能且毒副作用很小，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂。

高良姜为姜科山姜属植物高良姜(Alpinia officinarumHance)的干燥根茎，又名风姜、小良姜，具有温胃、祛风、散寒、行气、止痛的功效。用于脘腹冷痛、胃寒呕吐、暖气吞酸[2]。大高良姜为姜科山姜属植物大高良姜(Alpinia galangalWilld)的根茎，又名大良姜、良姜、山姜，是《中国药典》收载的植物类药材，果实入药称为红豆蔻，味辛、性热，能散寒、暖胃、止痛，用于胃脘冷痛，脾寒吐泻，其根茎亦供药用[3]。

高良姜与大高良姜同属于姜科植物，是中药中重要的配伍成分，二者都含有较丰富的黄酮类化合物，却有不同的功效。目前国内外尚无对二者总黄酮抗氧化活性的异同进行比较研究，本实验主要对二者体外抗氧化活性的强弱进行比较，以提供它们药效差异的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

高良姜、大高良姜购于陕西省药材市场。

乙醇(75%)、石油醚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、FeSO4·7H2O、DPPH、H2O2、抗坏血酸(VC)、二丁级羟基甲苯(BHT，食品级)。

RE-52AA型旋转蒸发仪、SHZ-Ⅲ型循环真空泵 上海亚荣生化仪器厂；AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HHW-21CU-600型电热恒温水槽、DGX-9073B-1电热鼓风干燥箱 上海福玛实验设备有限公司；Alphal-4型真空冷冻干燥机 德国Chris公司；WFJ2000型可见分光光度计 尤尼柯(上海) 仪器有限公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；800B型离心机 上海安亭科学仪器厂；FW-80型高速粉碎机 河北省黄骅市新兴电器厂。

1.2 方法

1.2.1 高良姜和大高良姜黄酮粗提物的制备

称取烘干的高良姜和大高良姜各15g，过40目筛，用石油醚脱脂24h，挥干石油醚，然后以50%乙醇为提取溶剂，料液比1:75，提取温度80℃，提取5h，提取液于3000r/min离心20min，取上清液。将得到粗提液减压浓缩至膏状，用少量蒸馏水溶解所得到的浓缩物，直至无色。然后将得到的浓缩物真空冷冻干燥2 4 h，得到干的黄酮粗提物，备用。

1. 2. 2 高良姜和大高良姜中黄酮类组分总还原能力的测定[4]

在10mL的试管中依次加入2.5mL、pH6.6的磷酸缓冲溶液，1mL不同质量浓度提取物溶液和1mL 1g/100mL铁氰化钾溶液，摇匀，50℃水浴加热20min，急速冷却，再加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸并摇匀，取出5mL再加入5mL蒸馏水和1mL 1g/100mL FeCl3，混匀后静置10min，于700nm波长处测定吸光度，以蒸馏水调零，VC作为阳性参照，每组做3个重复，求其平均值，吸光度越大，说明总还原能力越强。

1.2.3 高良姜和大高良姜中黄酮类组分清除超氧阴离子自由基的能力[5]

取0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH8.2)4.5mL，置于25℃水浴中预热20min，分别加入1mL试样和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入8mol/L HCl 1mL终止反应，于299nm波长处测定吸光度(Ai)，空白对照组以相同体积的蒸馏水取代样品，测定吸光度(A0)，以VC作为阳性对照。每个实验组需重复3次，求其平均值[6]。

1.2.4 高良姜和大高良姜中黄酮类组分清除羟自由基的能力[7]

移取25mL 2mmol/L FeSO4溶液，25mL 6mmol/L H2O2溶液于150mL的锥形瓶中，混合均匀后加入75mL 6mmol/L水杨酸溶液，在37℃的水浴中反应15min，然后在波长510nm处测吸光度(A0)，从以上的测定体系中取24mL于25mL的比色管中，再加入1mL不同质量浓度的提取物溶液，37℃的水浴中反应15min后，于波长510nm处测其吸光度(Ax)，以VC和BHT作为阳性对照。每个实验组需重复3次，求其平均值。

1.2.5 高良姜和大高良姜中黄酮类组分清除DPPH自由基的能力[8]

准确称取20mg DPPH试剂，用无水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶，配制成2×10-4mol/L的溶液。取2mL样品溶液及2mL 2×10-4mol/L DPPH溶液加入同一具塞管中，加入1mL无水乙醇使反应总体积达到5mL，摇匀[9]。反应30min后在最大吸收波长517nm处测定吸光度(A0)，计算DPPH自由基的清除率，根据公式(3)计算清除率，以VC作为对照品。各个实验组需重复3次，求其平均值。

式中：A0为2mL DPPH溶液+2mL样品溶剂+1mL无水乙醇的吸光度；Ai为2mL DPPH溶液+2mL样品溶液(或对照品溶液)+1mL无水乙醇的吸光度；Aj为2mL无水乙醇+2mL样品溶液(或对照品溶液)+1mL无水乙醇的吸光度。

1.2.6 半数清除质量浓度(EC50)的测定

EC50指清除率为50%时所需样品的质量浓度。所需质量浓度越低，表明半清除率越高，清除效果越好[10]。将各项实测数据用拟合优化法来模拟S曲线，可通过Scatchard法和Hill法使量效关系S型曲线直线化[11]，并得出线性方程y＝mx＋c，从中即可计算出EC50值。

2 结果与分析

2.1 总还原能力测定

图1 大高良姜和高良姜总黄酮与VC的总还原能力Fig.1 Total reducing power of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC

如图1所示，高良姜和大高良姜总黄酮都具有良好的还原能力；随着样品中总黄酮质量浓度的增大，还原能力逐渐增强。在所测定的质量浓度范围内，大高良姜的还原能力大于高良姜，但都明显弱于VC。

2.2 对超氧阴离子自由基的清除效果

图2 大高良姜和高良姜总黄酮与VC清除O2·的能力Fig.2 Scavenging capacities of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC against superoxide anion radicals

如图2所示，大高良姜和高良姜总黄酮对超氧阴离子自由基都有一定的清除能力，并且随着黄酮化合物质量浓度的增大而增加。同时，在所测定的质量浓度范围内，大高良姜的清除效果微高于高良姜，但二者的清除率都明显弱于VC。

2.3 对羟自由基的清除效果

羟自由基是已知最强的氧化剂，对细胞和组织的破坏作用最大。利用Fenton反应产生羟自由基：H2O2＋Fe2+=·OH＋OH－＋Fe3+，水杨酸能有效的捕捉·OH，并产生有色产物2,3-二羟基苯甲酸，该物质在510nm波长处有强吸收，若在此反应体系中加入具有·OH功能的物质，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色物质产物生成量减少[13-14]。

图3 大高良姜和高良姜总黄酮、VC与BHT清除·OH的能力Fig.3 Scavenging capacities of total falvonoids from Alpiniaofficinarum Hance and Alpinia galangal Willd, VC and BHT against hydroxyl free radicals

由图3可知，高良姜和大高良姜总黄酮对·OH均有一定的清除作用。当样品质量浓度在0.1～0.4mg/mL时，随着样品质量浓度的增加清除率逐渐增加，但当质量浓度增大至0.4mg/mL之后，清除率随着质量浓度的增加而减小。在所测定的质量浓度范围内，高良姜的清除效果强于大高良姜，但都明显弱于VC，微弱于BHT。

2.4 对DPPH自由基的清除效果

自由基消除反应是抑制机体过氧化过程的主要机制之一，样品清除自由基的能力反映其抗氧化活性的高低。DPPH自由基是一种很稳定的氮中心的自由基，其结构中含有3个苯环，1个N原子上有1个孤对电子，呈紫色，在517nm波长处有强吸收。DPPH自由基和抗氧化剂相混合，随着DPPH自由基与抗氧化剂提供的氢相结合，孤对电子被配对，使体系颜色由紫色变成淡黄色，吸光度减小，反应结束后达到稳定。DPPH自由基剩余百分率与抗氧化剂的清除能力相对应，因此可用分光光度法进行定量分析[15]。

图4 大高良姜和高良姜总黄酮与VC清除DPPH自由基的能力Fig.4 Scavenging capacities of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd, VC and BHT against DPPH free radicals

由图4可知，高良姜、大高良姜总黄酮和VC对DPPH自由基都有很强的清除作用，且随着样品质量浓度的增加清除效果逐渐增强。最大清除率分别为94%、94.4%和96.3%，当质量浓度达到0.8mg/mL时，高良姜和大高良总姜黄酮的清除率均达到最大。结果表明，大高良姜的清除能力大于高良姜，但均微弱于VC。

2.5 半数清除质量浓度(EC50)测定结果

EC50值越低，表明清除率越高，清除效果越好[4]。由图5可知，大高良姜总黄酮清除DPPH自由基的EC50值(0.1018mg/mL)小于高良姜(0.1021mg/mL)，二者之间差异不显著(P＞0.05)；大高良姜总黄酮清除·的EC50值(1.3185mg/mL)大于高良姜(1.2887mg/mL)，表明高良姜总黄酮半清除率较高，但都小于VC；高良姜总黄酮清除·OH的EC50值(0.1225mg/mL)大于大高良姜(0.1142mg/mL)，表明大高良姜总黄酮半清除率较高，但小于VC。表1所示为大高良姜、高良姜和VC清除自由基的95%置信区间。

图5 大高良姜和高良姜总黄酮与VC清除自由基的EC50值Fig.5 Half maximal effective concentrations (EC50) of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC for scavenging DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radicals

表1 大高良姜和高良姜总黄酮与VC清除自由基的置信区间(x± s，n=5)Table 1 Confidence intervals of free radical scavenging activity of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC (x± s，n=5)

3 结 论

本实验采用体外产生的活性自由基系统，通过测定样品中总黄酮对自由基的清除作用，从而对高良姜和大高良姜的抗氧化能力进行比较研究。在所测定的质量浓度范围内，大高良姜对DPPH自由基的清除能力强于高良姜；对O2·的清除能力，二者相差不大；而对·OH清除作用时，高良姜的清除能力微弱于大高良姜，但都弱于天然的抗氧化剂VC和BHT。实验结果证明，高良姜和大高良姜的总黄酮粗提物都具有很好的抗氧化活性，但二者的抗氧化活性存在一定的差异。总体而言，大高良姜的抗氧化活性强于高良姜，从而为二者在药效差异上提供了一定的实验依据。

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Comparison of Antioxidant Activity of Total Flavonoids fromAlpinia officinarumHance andAlpinia galangalWilld

WANG Bei-bei，NIU Fu-ge，DUAN Yu-feng*
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

The main purpose of this study was to comparatively investigate the antioxidant activity of total flavonoids fromAlpinia officinarumHance andAlpinia galangalWilldin vitro. The antioxidant evaluation was achieved by using DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radical systems and comparing with the reference materials VC and BHT. In a certain concentration range (0.05－0.5 mg/mL), the scavenging rates of total flavonoids fromAlpinia officinarumHance andAlpinia galangalWilld against DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radical were found to be 94.0% and 94.4%, 82.1% and 80.7%, and 16.6% and 16.7%, respectively, slightly inferior to those of VC and BHT. In general, total flavonoids fromAlpinia galangalWilld are better antioxidants than those fromAlpinia officinarumHance.

Alpinia officinarumHance；Alpinia galangalWilld；total flavonoids；antioxidant activity

TS255.1

A

1002-6630(2011)07-0117-04

2010-07-06

王蓓蓓(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品功能成分开发及利用。E-mail：fairy-miracle0516@stu.snnu.edu.cn

*通信作者：段玉峰(1955—)，男，教授，博士，研究方向为食品功能成分开发及利用、天然产物化学。E-mail：yfduan@snnu.edu.cn