金属离子对产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧发酵代谢的影响

郑晓宇，李 建，方晓江，陈可泉，奚永兰，姜 岷

（南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 210009）

研究开发

金属离子对产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧发酵代谢的影响

郑晓宇，李 建，方晓江，陈可泉，奚永兰，姜 岷

（南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 210009）

考察了培养基中分别添加Mg2+、Mn2+、Co2+3种金属离子对Actinobacillus succinogenesNJ113菌体生长及产酸的影响，并进行了代谢通量分析。结果表明培养基中分别添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+、2 mmol/L Co2+后流向HMP途径的通量r17比对照组分别提高了445.38%、176.23 %和171.67%，使得还原力不足的矛盾得到缓解；流向C4途径的通量r13比对照组分别提高了57.70%、15.94%和2.91%；最终使得流向丁二酸的通量r16比对照组分别提高了 62.69%、18.91%和 5.01%。此外，关键酶活分析结果显示分别添加 Mg2+、Mn2+以及 Co2+后，PEP羧化激酶（Pck）比活力由对照组的339.18 U/mg分别提高到568.732 U/mg、728.049 U/mg和339.686 U/mg。最终当培养基中分别添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+、2 mmol/L Co2+后丁二酸产量分别为27.83 g/L、26.27 g/L和23.54 g/L，比对照的22.79 g/L分别提高22.11%、15.27%以及3.4%。

产琥珀酸放线杆菌NJ113；丁二酸；Mg2+、Mn2+、Co2+；代谢通量分析

丁二酸（俗名琥珀酸）是生物炼制产品工程中优秀的碳四平台化合物，其可以作为许多重要的中间产物和专业化学制品。传统的生产方法是采用石化法，污染大，成本高，严重抑制了丁二酸作为大宗化学品的发展潜力。随着生物工程技术的迅速发展和成熟，生物转化法生产丁二酸由于其高效率、环保性以及原料的可再生性而引起许多研究者的注意[1-2]。

产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）是从瘤胃中筛选出的丁二酸高产菌株，McKlinlay等[3]利用13C原子标记确定了产琥珀酸放线杆菌的代谢途径，结果表明磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）是代谢过程中的一个重要节点，而代谢途径中关键酶则是磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（Pck）和丙酮酸激酶（Pyk）[4-5]。一方面Pck催化PEP生成草酰乙酸（OAA），进而合成丁二酸；另一方面PEP又在Pyk的催化下生成丙酮酸（PYR），进而生成甲酸、乙酸等副产物。因此这两个过程所占通量比例大小直接影响丁二酸的产量，而Pck和Pyk这两种酶的酶活直接影响了这两个通量的比例。影响Pck和Pyk酶活的因素有很多，除了发酵液中的CO2[6-7]和发酵液pH值[8]会对两种酶的酶活有影响外，一些二价金属离子也会对两者有影响。国内外众多研究者[9-13]对Pck进行生化特性分析发现，Mg2+、Mn2+和Co2+对Pck酶活有明显的激活作用。

作者利用实验室筛选的一株丁二酸高产菌Actinobacillus succinogenesNJ113，从代谢通量分析角度，考察适量添加 Mg2+、Mn2+和 Co2+对A. succinogenesNJ113代谢通量分布及关键节点的影响，并结合关键酶酶活分析说明其影响机理，为优化发酵过程提供参考。

1 实验材料与方法

1.1 生产菌株

Actinobacillus succinogenesNJ113（本实验室筛选并保存）。

1.2 培养基

1.2.1 种子培养基

葡萄糖 10 g/L（分开灭菌），酵母膏 5 g/L，玉米浆干粉 2.5 g/L，NaHCO310 g/L，NaH2PO4·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4·3H2O 15.5 g/L，121 ℃灭菌15 min。

1.2.2 发酵培养基

葡萄糖 40 g/L（分开灭菌），酵母膏 10 g/L，玉米浆干粉 7.5 g/L，乙酸钠 1.36 g/L，K2HPO43 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl20.2 g/L，NaH2PO4·2H2O 1.6 g/L，Na2HPO4·3H2O 0.31 g/L，121 ℃灭菌15 min。

1.3 培养方法

种子用100 mL血清瓶培养，装液量50 mL，接种量2 %，于37 ℃、200 r/min摇床中培养10 h；3 L（BioFlo 110 fermentor；New Brunswick Scientific Co.，Edison，N.J.）发酵罐装液量1.5 L，接种量7 %（体积分数），在37 ℃、搅拌转速200 r/min、CO2通气量0.5 L/min、以25% Na2CO3为pH值调节剂维持pH值在6.8。

1.4 分析方法

1.4.1 葡萄糖含量的测定

生物传感分析仪（SBA240C，山东省科学院生物研究所）。

1.4.2 菌体密度的测定

将发酵液用去离子水稀释适当倍数，使A660值在0.2～0.8之间，用紫外可见分光光度计测定。菌液浊度OD660=A660×稀释倍数。

1.4.3 细胞干重的测定

称出干燥10 mL离心管质量（G1），取5 mL发酵液置于离心管中，9000 r/min离心5 min，弃上清液；再用5 mL生理盐水清洗两次，离心，于60 ℃烘箱中干燥至恒重，称重（G2），则细胞干重DCW＝(G2－G1)/5。

1.4.4 产物含量的测定

采用高效液相色谱法（HPLC），色谱柱为Aminex® HPX-87H型离子排斥色谱柱（300 mm ×φ7.8 mm，5 μm），流动相为5 mmol/L H2SO4水溶液，流速0.6 mL/min，进样体积20 μL，柱温55 ℃，丁二酸、乙酸、甲酸、乳酸等利用紫外检测器检测，检测波长为215 nm，乙醇利用折光示差检测器检测[14]。

1.4.5 酶活的测定

细胞提取液的制备：取5 mL发酵液于10 mL离心管中，8000 r/min、4 ℃离心5 min，弃去上清液，用5 mL Tris-HCl（0.1 mol/L，pH值7.0）溶液洗涤两次后将细胞悬浮，置于冰槽中超声破碎 20 min；结束后8000 r/min、4 ℃离心5 min，将上清液转入另一离心管中，保存在－80 ℃冰箱内待用。

蛋白质浓度的测定：Bradford法，以牛血清白蛋白作为标准[15]。

Pck酶活测定体系：0.3 mol/L Tris-HCl（pH值6.6），0.3 mol/L MgCl2，0.15 mol/L MnCl2，1.125 mol/L NaHCO3，12 U/mL 苹果酸脱氢酶，0.1 mol/L ADP·Na2，3 mmol/L烟酰胺腺嘌吟二核苷酸（NADH），0.15 mol/L PEP，细胞提取液；所有底物于37 ℃水浴20 min，然后采用联机紫外可见分光光度计于340 nm处测定反应的初速度。

Pyk酶活测定体系：0.3 mol/L Tris-HCl（pH值7.5），0.3 mol/L MgCl2，0.75 mol/L KCl， 12 U/mL 乳酸脱氢酶，0.1 mol/L ADP·Na2，3 mmol/L NADH，0.15 mol/L PEP，细胞提取液；所有底物于37 ℃水浴 20 min，然后采用联机紫外可见分光光度计于340 nm处测定反应的初速度。

一个酶活力单位（U）定义为1 min催化1 nmol底物转化为产物的量；比活力为每mg蛋白质所含的酶活力单位数。

式中，V为反应体系体积，mL；ε为摩尔消光系数，cm2/mol；v为样品量，mL；L为比色杯光径，cm；ΔA为吸光度变化、109为将mol换算成nmol。

1.4.6 代谢过程及通量分析

利用姜岷等[16]建立的A. succinogenesNJ113以葡萄糖作为碳源合成丁二酸的代谢网络和代谢通量计算方法，采用拟稳态假设，根据发酵过程中葡萄糖消耗速率，丁二酸、甲酸、乙酸、乳酸、乙醇以及生物量的合成速率（r1、r16、r11、r9、r10、r12、rBM），并利用 MATLAB软件计算出各个途径的代谢通量。整个代谢网络包括24个代谢反应方程，18种代谢中间产物，见表1、表2。

表1 代谢反应方程

续表

表2 代谢通量方程

2 结果与讨论

2.1 添加不同浓度的金属离子对发酵的影响

本实验在100 mL血清瓶中发酵考察培养基中添加不同浓度的 Mg2+、Mn2+及 Co2+，在初始葡萄糖浓度为20 g/L时对菌体产丁二酸的影响，结果见表3。

由表3可以看出，添加不同金属离子对丁二酸产量都有一定的影响。其中添加Mg2+、Mn2+对产酸均有一定的促进作用，其中添加Mg2+的效果最好，Mn2+其次，Co2+影响最小。当Mg2+离子添加浓度为6 mmol/L时，丁二酸产量达16.71 g/L，丁二酸收率达到 83.55%，较对照提高 25.9%；当Mn2+离子添加浓度为6 mmol/L时，丁二酸产量达15.36 g/L，丁二酸收率达 76.80%，较对照提高19.2%；当Co2+离子添加浓度为2 mmol/L时，丁二酸产量达到最大，为 12.39 g/L，丁二酸收率达61.95%，较对照组提高4.3%。而继续增加离子浓度对菌体生长及丁二酸产量有一定的抑制作用，甚至出现下降趋势。

表3 添加不同金属离子对发酵的影响

2.2 添加不同金属离子对发酵结果的影响

在3 L罐中分别考察初糖浓度为40 g/L时培养基中分别添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+以及2 mmol/L Co2+对A. succinogenesNJ113厌氧发酵制备丁二酸的影响，结果见图1。

从图1可以看出添加不同金属离子对菌体生长和丁二酸产量均有一定的影响。其中培养基中添加6 mmol/L Mn2+菌体最高OD达11.93，较对照的9.46增加26.1%，培养基中添加6 mmol/L Mg2+时菌体最高OD达10.33，比对照提高9.1%，另外当培养基中添加2 mmol/L Co2+菌体最高OD为9.80，虽然仅与对照相差不大，但是其稳定期维持时间较长，也有利于丁二酸产量的增加。金属离子对菌体生长的促进作用也使得丁二酸产量的提高，培养基中未添加金属离子时丁二酸的产量为22.79 g/L，当培养基中分别添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+以及2 mmol/L Co2+时丁二酸最终产量分别为27.83 g/L、26.27 g/L和23.54 g/L，比对照分别提高22.11%、15.27%以及3.40%。

2.3 添加不同金属离子对代谢通量分布的影响

图2为A. succinogenesNJ113代谢途径，代谢通量分析可以直观地反映细胞的代谢能力[17]。对A. succinogenesNJ113进行代谢通量分析，分别选择在9 h、9.5 h、10 h、10.5 h、11 h（即稳定期）取样分析发酵液中的细胞干重、葡萄糖、丁二酸、乙酸、甲酸、乳酸以及乙醇的浓度，得到在10 h时的单位时间浓度变化率[mmol/(gDCW·h)]，并计算得到各反应的代谢通量。添加不同金属离子后代谢通量分布情况见表4。

由表4可以看出在发酵稳定期（10 h），添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+时生物量通量分别为25.76 mmol/(gDCW·h)、25.66 mmol/(gDCW·h)，与对照24.89 mmol/(gDCW·h)相差不大；当培养基中添加 2 mmol/LCo2+时生物量通量为 37.28 mmol/(gDCW·h)，比对照提高了49.78%，使得发酵稳定期延长。

图1 添加不同金属离子对A. succinogenes NJ113发酵过程的影响

图2 A. succinogenes NJ113的代谢途径

表4 不同金属离子对代谢通量分布的影响

通量变化主要在糖酵解途径（EMP）（r2）、磷酸戊糖途径（HMP）（r17）、C3（r6）及C4（r13）途径的摩尔通量上，其中PEP是影响丁二酸合成的关键节点，PYR是影响乙酸、甲酸等副产物生成的关键节点。培养基中添加金属离子Mg2+、Mn2+、Co2+后流向HMP与EMP途径的通量比（r17∶r2）分别为45.43∶54.23、23.01∶75.71和22.69∶76.04，而对照的r17∶r2仅为8.33∶88.54。丁二酸生成过程中，菌体通过EMP途径将1 mol葡萄糖生成2 mol PEP的同时生成2 mol NADH，但是2 mol PEP生成2 mol丁二酸的同时则需消耗4 mol NADH，乙酸、甲酸等副产物的生成过程未涉及 NADH的消耗和生成，可见，丁二酸合成过程中存在还原力不足的现象；而HMP途径中1 mol G6P生成1 mol RL5P的同时生成 2 mol烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），2 mol NADPH能生成2 mol NADH。因此，HMP途径通量r17越大越有利于菌体代谢过程中还原力[H]的生成，进而有利于丁二酸的产生，由代谢通量分布看出，培养基中添加这3种金属离子均使得HMP途径通量比提高，其中添加Mg2+时 HMP途径通量比最高，Mn2+次之，Co2+最低。

此外培养基中分别添加Mg2+、Mn2+、Co2+后流向 C4途径的通量r13分别为 160.14 mmol/（gDCW·h）、117.74 mmol/（gDCW·h）、104.51mmol/（gDCW·h），比对照组分别提高了57.70%、15.94%和2.91%；丁二酸代谢通量r16分别为157.83 mmol/（gDCW·h）、115.35 mmol/（gDCW·h）和 101.87 mmol/（gDCW·h），与对照组丁二酸通量97.01 mmol/（gDCW·h）相比，分别提高了62.69%、18.90%和5.01%。同时，培养基中分别添加6 mmol/L Mn2+、6 mmol/L Mg2+、2 mmol/L Co2+后流向C3途径的通量r6均有所降低，使得更多的碳源用于合成产物丁二酸，最终提高了丁二酸产量。

2.4 添加不同金属离子对关键酶活的影响

菌体代谢过程中的每一个代谢反应都是由特定的酶催化的，酶活力的大小直接影响各代谢反应速率，进而影响整个代谢网络的通量分布，因此引起上述代谢通量分布变化的原因可能是这3种二价金属离子影响了A. succinogenesNJ113代谢过程中的一些关键酶尤其是 Pck和 Pyk酶的酶活。Podkovyrov等[9]研究发现这3种金属离子对Pck酶活均有影响。本实验检测培养基中添加3种金属离子后对发酵稳定期时（10 h）过程中关键酶的酶活，并与对照比较，结果见图3。

图3 不同金属离子对关键酶活的影响

由图3可以看出，这3种金属离子对Pck和Pyk都有不同程度的影响。Mn2+对Pck和Pyk酶活影响最大，Pck比活力分别由对照组的339.18 U/mg增至728.05 U/mg，提高了135.48%，Pyk比活力由262.34 U/mg增至435.19 U/mg，提高了65.88%，虽然Mn2+使得Pck酶活提高最多，但同时它使得Pyk酶活大大提高，这对C4途径通量增加是不利的；Mg2+对 Pck酶活影响较大，当培养基中添加Mg2+后 Pck增至 568.73 U/mg，比对照提高了83.95%，Pyk比活力则为282.33 U/mg，比对照提高了7.62%；当培养基中添加Co2+后Pck和Pyk比活力分别达到339.69 U/mg 和273.55 U/mg，与对照相比分别提高了 9.87%和 4.27%。显然这 3种二价金属离子均有利于提高Pck酶活，进而使得进入C4途径的通量增加，进入 C3途径的通量减少，最终合成更多的丁二酸，同时降低乙酸、甲酸等副产物的产量。经过比较，在培养基中添加 Mn2+在提高 Pck酶活的同时也提高了 Pyk酶活，不利于提高C4途径通量，进而影响丁二酸产量；而Mg2+在提高Pck酶活的同时对Pyk酶活的影响不大，因此 Mg2+最有利于A.succinogenesNJ113产丁二酸。

3 结 论

添加上述3种二价金属离子对菌体生长及发酵产丁二酸均有一定的影响，并且均有利于A. succinogenesNJ113 产丁二酸。通过代谢通量分析方法，结果表明培养基中分别添 Mg2+、Mn2+以及Co2+后流向HMP途径的通量r17和流向C4途径的通量r13较对照都有不同程度提高，最终导致流向丁二酸的通量r16提高。此外，关键酶活分析结果显示Mg2+、Mn2+以及Co2+对Pck和Pyk酶活均有不同程度的影响，其中Co2+对Pck和Pyk酶活均有提高，但影响最小；Mn2+在提高Pck酶活的同时也使得 Pyk酶活大大提高，这对 C4途径通量增加是不利的；Mg2+在提高Pck酶活的同时对Pyk酶活的影响不大，因此最有利于A.succinogenesNJ113产丁二酸。最终当培养基中分别添加 6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+、2 mmol/L Co2+后丁二酸产量分别为27.83 g/L、26.27 g/L、和23.54 g/L，比对照的22.79 g/L分别提高22.11%、15.27%以及3.4%。

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Effect of metal ions on fermentation and metabolization ofActinobacillus SuccinogenesNJ113

ZHENG Xiaoyu，LI Jian，FANG Xiaojiang，CHEN Kequan，XI Yonglan，JIANG Min
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，Jiangsu，China）

The effects of adding Mg2+，Mn2+，Co2+on cell growth and succinic acid production was investigated. The metabolic flux ofActinobacillus succinogenesNJ113 was calculated. It was found that the flux of HMP increased by 445.38%，176.23 % and 171.67% after adding 6 mmol/L Mg2+，6 mmol/L Mn2+， 2 mmol/L Co2+respectively，thus the reducing power was better balanced. The flux of C4was 57.70%，15.94% and 2.91% higher respectively，which led to the improvement of succinic acid flux by 62.69%，18.91% and 5.01%. The key enzyme activity analysis showed that the specific activity of PEP carboxykinase（Pck）reached 568.732 U/mg，728.049 U/mg and 339.686 U/mg with 6 mmol/L Mg2+，6 mmol/L Mn2+，2 mmol/L Co2+addition respectively. As a result，the concentration of succinc acid was 27.83 g/L，26.27 g/L，and 23.54 g/L，while the concentration of control was only 22.79 g/L.

Actinobaccilus succinogenesNJ113；succinic acid；Mg2+，Mn2+，Co2+；metabolic flux analysis

T 921

A

1000–6613（2011）07–1591–07

2010-12-21；修改稿日期：2011-02-18。

国家 973计划（2011CB707405）、国家自然科学基金（21076105）、材料化学工程国家重点实验室基金及江苏省“青蓝工程”共同资助项目。

郑晓宇（1986—），女，硕士研究生。E-mail zhengxiaoyu123 @sina.cn。联系人：姜岷，教授。E-mail bioengine@njut.edu.cn。