奶山羊青春期乳腺发育重要基因RelA的全长克隆

王立娜，苑春艳，李春，李庆章，高学军

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

奶山羊青春期乳腺发育重要基因RelA的全长克隆

王立娜，苑春艳，李春，李庆章，高学军

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

从本实验室已建立的关中奶山羊7个时期乳腺Long-SAGE标签库中筛选出在青春期高表达的RelA基因，用RACE方法克隆并获得关中奶山羊RelA基因的全长，将全长序列与NCBI GenBank中人（H.sapiens）和牛（Bos taurus）数据库进行同源性比对，证实用所选EST标签引物克隆出的基因全长是奶山羊RelA基因。

奶山羊；乳腺；RACE；RelA

0 引言

cDNA微阵列杂交技术（cDNA mivroarray hybridization）、长标签基因表达系列分析（Long Serial Analysis of Gene Expression，Long SAGE）等方法使具有潜在功能意义的EST（expressed sequence tag，EST）片段数量大量增加[1]，然而EST片段所对应的新基因全长序列的获得，仍然是进行新基因功能研究的障碍[2-5]，cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）技术使未知基因的快速扩增成为可能[6,7]。

目前，人、小鼠、牛等物种的核因子κB（NF-κB）亚单位RelA（V-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A(avian)，RelA）基因已经克隆出来，但是关于羊的RelA研究还没有报道。为进一步探讨RelA的功能，阐明其在乳腺中发挥的生物学作用，本研究拟通过已构建的奶山羊乳腺EST标签库获得的RelA特异性标签，采用RACE技术克隆关中奶山羊乳腺新基因RelA全长cDNA序列，为进一步研究基因RelA的功能奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

关中奶山羊青春期乳腺组织（液氮保存），SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Code No：634914），Trizol（Code No:DRR02AG），pMD18-T载体，DNA Ladder 2000 Marker，PCR仪。

1.2 引物设计

根据本实验室已建立的关中奶山羊乳腺Long-SAGE标签库，选取RelA基因的EST标签，碱基序列为CTGATGGAGTACCCTGA，其NCBI BLAST结果在牛、人的RelA基因同源性为100%。以标签本身作为3'RACE基因特异性引物W6：5'–catgctgatggagtaccctga–3'，以3'RACE结果设计5'RACE的基因特异性引物RelA 1：5'–CCCGAGAGGAGGCCATTGGTGAG–3'。SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒提供通用引物：10×universal Primer A Mix（UPM），Long（0.4 μmol/L）：5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'，Short（2 μmol/L）：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'，Nesteduniversal Primer A（NUP；10 μmol/L）5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'。

1.3 奶山羊乳腺组织总RNA的提取及cDNA的获得

取液氮保存的奶山羊青春期乳腺组织（80 mg左右）在液氮中研磨成细粉，采用Trizol试剂提取总RNA。经甲醛变性凝胶电泳及紫外分光光度计测定OD值分析RNA的完整性及浓度，保存于液氮中备用。

按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书进行反转录，取2个0.2 mL的PCR管，5'RACE cDNA加入2 μL总RNA、1uL 5'–CDS primer、1uL SMARTⅡA oligo（12m/L）、1 μL灭菌水；3'RACE cDNA加入2 μL总RNA、1 μL 3'-CDS primer和2 μL灭菌水。轻轻混匀，于70℃加热2 min，冰上冷却2 min，离心使液体沉淀。加入2 μL 5×第一链缓冲液、1 μL DTT（20 mmol/L）、1 ul dNTP Mix（10 nmol/L）、1μL的MMLV逆转录酶，轻转混匀，离心使液体沉底，金属浴42℃（1.5 h），加入20 μL灭菌水，于70℃加热2 min灭活，获得3'cDNA和5'cDNA冻存于-20℃备用。

1.4 奶山羊RelA基因3'端序列和5'端序列的获得

用通用引物混合物UPM、W6引物进行3'RACE PCR扩增，25 μL的PCR体系为：4 μL的dNTP、灭菌水、3 μL的UPM、12.5 μL的2×GC BufferⅠ、3/5 RACE引物、3'/5'LA Taq酶0.25 μL。采用降落PCR进行扩增以提高特异性，扩增参数为：94℃2 min；94℃30 s，72℃2 min，12个循环；94℃30 s，70℃30 s，72℃3 min，5个循环；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，30个循环，△T为-0.6℃；72℃，7 min。1.2%琼脂糖凝胶电泳并回收特异性片段，将回收的DNA经16℃过夜连接至pMD18-T载体，然后进行转化，在含有Amp抗性的LB培养基筛选后，挑选单菌落并在含有Amp抗性的5 mL液体培养基中摇菌过夜，菌液用M13通用引物进行PCR验证，挑选正确条带的菌液送北京英骏生物公司进行测序，每个测序片段分别挑选3个平行菌。

以3'RACE测序序列设计5'端引物RelA 1，PCR程序同上，胶回收特异性片段，克隆连接至pMD18-T载体。经含Amp抗性的LB培养基筛选后，挑选单菌落，菌液用M13通用引物验证，挑选验证正确的菌液送北京英骏生物公司进行测序，每个测序片段分别挑选3个平行菌。

1.5 奶山羊RelA基因全长的扩增与鉴定

将3'RACE和5'RACE扩增的结果用Contig Express生物学软件拼接，初步得出全序列，按照拼接结果设计全长引物。引物序列为：

RelA上：5'-ATTGGTGAGGAGGGAGTAGGGT-3'

RelA下：5'-AGTAAAAACTGAGCCTCCTGACT G-3'

总RNA经反转录合成cDNA第一链，以cDNA为模板经PCR扩增RelA基因全长。PCR体系同上，扩增参数为：94℃2 min；94℃30 s，70℃30 s，72℃3 min，5个循环，△T为-1.0℃；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25个循环；72℃，7 min。将PCR产物回收连接至pMD18-T载体，转化Top10感受态细胞，涂含Amp抗性的培养板经筛选后挑取单个菌落，酶切验证后将3个平行菌液送北京英骏公司测序。

1.6 奶山羊RelA基因序列分析

使用Gene Runner，DNAMAN，CLUSTAL，PHYLIP等生物学软件，对奶山羊RelA基因序列及对应氨基酸序列进行分析，并与其他物种的RelA序列进行比较。

2 结果与分析

2.1 总RNA的电泳结果

总RNA提取后，用甲醛变性胶电泳和紫外分光光度计检测RNA质量。电泳条带以28S rRNA和18S rRNA为主（图1），5S rRNA条带模糊；OD值为1.95，在1.8～2.0之间，表明所提RNA纯度较高，完整性较好，可满足下一步试验。

总RNA为模板，经MMLV进行反转录后，用GAPDH看家基因进行验证，PCR产物经电泳后可见一条296 bp左右的条带，阴性对照无条带（图2），表明反转录成功。

2.2 奶山羊RelA基因3'端序列和5'端序列的获得

用试剂盒提供的引物UPM和W6进行RACE PCR反应，采用降落PCR以提高产物特异性，获得一条特异性PCR条带，片段大小为997 bp（图3），其3'端有poly（A）尾巴。5'RACE扩增根据3'端序列结果设计的引物与UPM扩增，扩增得到一条735 bp的条带，其5'RACE的3'端引物为3'RACE上的一段反向序列，与其5'端有116 bp的重叠。

图1 总RNA提取的电泳结果

图23 'cDNA和5''cDNA验证电泳结果

图3 奶山羊RalA的3'RACE和5'RACE电泳图

2.3 奶山羊RelA基因全长的获得

根据3'末端（997 bp）和5'末端（735 bp）测序的结果，用全长上下游引物进行全长扩增，预计长度为1.5kb，回收PCR克隆产物，连接至pMD18-T载体测序，测序结果为1499bp，与预期结果相符（图4）。

图4 奶山羊RELA的全长电泳图

2.4 RelA基因核苷酸与氨基酸序列分析

根据3'末端997bp和5'末端735bp的测序结果，拼接cDNA全长为1 615bp，包括编码区和poly（A）结构，所得poly（A）尾巴含有25A，将cDNA全长经BLAST与其它物种进行同源性比对，结果为：牛（95%）、人（90%）、小鼠（77%）（图5）。cDNA全长的开放阅读框由第230位碱基处开始，到第802位碱基处结束，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，共可编码18种共190个氨基酸（图6），等电点为3.46，结构中包含有无规卷曲、β片层等二级结构，将其编码的氨基酸序列经FLAST与其它物种进行同源性比对，结果为：牛（100%）、人（100%）、小鼠（100%）。

图5 Mega作系统发生树分析

图6190 个氨基酸为Helical wheel图示

3 讨论

乳腺的发育情况显著影响其随后的泌乳功能，乳腺的充分发育是奶山羊等奶用动物高产的前提。如何调控奶山羊乳腺使之得到最充分的发育，从而具备最大泌乳潜能，是提高奶山羊等奶用动物单产的关键。在基因水平上对青春期乳腺发育进行研究，能够为最大限度地调控奶山羊乳腺发育提供理论依据，进而提高乳腺的泌乳量及乳品质，具有潜在的重要经济价值。目前，在乳腺研究中还没有对RelA基因的报道。根据关中奶山羊乳腺Long-SAGE文库中的数据分析[2-3]，RelA在乳腺发育的不同时期，表达丰度差异显著，只有在青春期高表达，妊娠一个月时表达量很低，在其后的泌乳期及退化期均不表达，由此看出，RelA基因在乳腺的青春期发育中起着一定作用，但其具体作用机制还不清楚，需要进一步深入研究。

采用RACE方法克隆未知基因，其正确序列的获得并非容易，RACE实验的成功很大程度上取决于引物的特异性以及cDNA模板的质量。RACE要求引物的GC含量在50%～70%，退火温度在65℃以上，以此提高引物的特异性。以EST标签序列作为RelA的特异性引物时，要在5'端加上构建Long-SAGE文库的标签酶NlaⅢ的识别序列“CATG”四个碱基，但因扩增之前并不知目的基因的片段大小，所以很难判断哪一条是目的带，因此增加了很多工作量。cDNA模板的质量也起着关键因素，只有用高质量的RNA逆转录得到的模板进行扩增，所扩增的目的条带才会有重复性。本实验选择用RelA表达丰度高的青春期乳腺组织提取RNA为模板，成功地克隆了奶山羊RelA基因的全长，为RelA基因的功能研究和进一步探讨RelA基因对奶山羊乳腺发育的调控奠定了实验基础。

[1] CHEN J J,SUN M,LEE S Y,et al.Identifying Novel Transcripts and Novel in the Human Genome by Using Novel SAGE Tags[J].Proc Notl Acad Sci USA,2002,99(19):12257-12262.

[2] 闫宏博，李庆章，高学军.奶山羊泌乳期乳腺Long-SAGE文库构建[Z].中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集:2008.

[3] 李春，李庆章，高学军.奶山羊乳腺Long-SAGE文库构建[C].中国畜牧兽医学会,2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集,2008.

[4]胡吉，王宣春，沈烨，等.采用cDNA微阵列杂交技术对垂体瘤基因表达谱的研究[J].复旦学报(医学版).2005(5):565-570.

[5] LU J,LAL A,MERRIMAN B,et al.A Comparison of Gene Expression Profiles Produced by SAGE,Long SAGE,and Oligonucleotide Chips[J].Genomics.2004,84(4):631-636.

[6] BOWER N I,JOHNSTON I A.Targeted Rapid Amplification of cDNA ends(T-RACE)--an Improved RACE Reaction through Degradation of Non-Target Sequences[J].Nucleic Acids Res.,2010.

[7] OZAWA T,KONDO M,ISOBE M.3'Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)Walking for Rapid Structural Analysis of Large Transcripts[J].J Hum Genet,2004,49(2):102-105.

[8] BESPALOVA I N,ADKINS S,BURMEISTER M.3'RACE:Skewed Ratio of Specific to General PCR Primers Improves Yield and Specificity[J].Biotechniques,1998,24(4):575-577.

[9] LANKIEWICZ S,GISSELMANN G,HATT H.Enhanced RACE Method Using Specific Enrichment by Biotinylated Oligonucleotides Bound to Streptavidin Coated Magnetic Particles[J].Nucleic Acids Res.,1997,25(10):2037-2038.

[10] FROHMAN M A,DUSH M K,MARTIN G R.Rapid Production of Full-Length cDNAs from Rare Transcripts:Amplification Using a Single Gene-Specific Oligonucleotide Primer[J].Proc Natl Acad Sci U S A.,1988,85(23):8998-9002.

Cloning of gene RelA in virgin mammary gland of dairy goat

WANG Li-na,YUAN Chun-yan,LI Chun,LI Qing-zhang,GAO Xue-jun
(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,College of Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The high expression gene RelA in virgin was screened from the Long-SAGE libraries established in this lab of 7 stages of Guanzhong dairy goat mammary gland.The full length of gene RelA sequence was cloned and obtained with RACE.Comparing the homology with H.sapiens and Bos taurus in NCBI GenBank,it was confirmed that the gene cloned with EST tag primer was exactly the gene RelA of dairy goat.

dairy goat；mammary gland；RACE；RelA

Q78,TS252.1

A

1001-2230（2011）02-0031-03

2010-11-30

黑龙江省国际合作项目（WB07A06），东北农业大学创新团队项目（CXT005-1-1/CXT005-1-2）。

王立娜（1985-），女，硕士，研究方向为泌乳生物学与乳腺生物功能调控。

李庆章