乳品中大肠菌群快速检测片的研究

段学辉，魏斌，傅奇，郭炳其，贾奎艳

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047）

乳品中大肠菌群快速检测片的研究

段学辉，魏斌，傅奇，郭炳其，贾奎艳

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047）

建立了乳品中大肠菌群检测片快速检测方法，即以国标法中的乳糖发酵管培养基为基本营养成分，优化添加辅助营养成分、指示剂、缓冲剂、选择性抑菌剂，通过冷水凝胶剂等均匀固化于基片上，样品滴加检测片上，培养16～18 h即可直接依据检测片颜色的变化定量检样中大肠菌群的含量，结果可用MPN值报告。实验以多管发酵法为对照，分别用标定菌浓的大肠杆菌菌液和市售乳品样进行对比检测，结果表明，检测片的最低检出限为0～4 mL-1，所测结果与国标法结果相比符合率为96.7%，样品检测报告时间缩短50多小时，两种方法所测结果在统计学上无显著性差异(P＞0.05)，快速检测片作为一种价廉、简单、快捷、准确的检测方法，能应用于乳品中大肠菌群的快速检测。

乳品；大肠菌群；快速检测片

0 引言

大肠菌群在食品安全中受到严格监控，是评价食品卫生质量的重要指标之一，大肠菌群的检测日益受到食品生产企业和卫生监测部门的高度关注。乳品中大肠菌群的检测通常采用国标多管乳糖胆盐发酵法，但乳品中的基质容易对结果造成干扰[1]，且检测耗时费力，报告一个阳性结果需要72 h，难以满足实际生产和监测中的快速检测需要。随着食品卫生检测技术的发展，酶分析法[2]、分子生物学法[3-5]和仪器分析法[6-8]等技术方法逐渐得到应用，但新方法对仪器设备和操作人员有特殊要求，生产企业和基层卫生监测部门的设备和操作水平难以适用。本文报道了一种大肠菌群快速检测片研制及其应用效果，为生产企业和监测部门提供了一种乳品中大肠菌群的快速检测方法。

1 实验

1.1 材料

菌种为大肠杆菌；鲜奶；酸乳；奶粉（市售）。

氯化三苯四氮唑（TTC）、氯化钠、磷酸氢二钾等均为分析纯，胆盐、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴甲酚紫、PEG、黄原胶、瓜尔豆胶、卡拉胶、聚丙烯酸钠、层析硅胶等均为化学纯，中速定性滤纸(规格为5cm×5 cm，11cm×11 cm)，聚乙烯树脂薄膜

1.2 培养基

营养琼脂：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，pH值为7.3±0.1，蒸馏水1 000 mL，121℃灭菌15 min。

乳糖胆盐发酵培养基[9]：蛋白胨20 g，乳糖10 g，胆盐5 g，氯化钠5 g，质量分数为0.04%溴甲酚紫溶液2.5 mL，蒸馏水1 000 mL，pH值为7.4，115℃灭菌15 min。

改良浸液配方：胰蛋白胨10 g，乳糖15 g，SDS 0.1 g，质量分数为2%的TTC溶液5 mL，磷酸氢二钾4 g，氯化钠3 g，质量浓度为1.6 g/100mL溴甲酚紫溶液4 mL，蒸馏水1 000 mL，115℃灭菌15 min。

1.3 菌悬液制备

划线甘油管中保藏的大肠杆菌于斜面培养基上，在37℃条件下培养24 h，用无菌生理盐水制成菌悬液。

检测流程如图1所示。

1.4 吸水率的测定[10]

分别称取0.1g干燥凝胶剂样品，放入300 mL烧杯中，加入100 mL去离子水，室温下溶胀1.5 h后，以100目滤网过滤15 min，记下滤液量，分别计算各凝胶剂在去离子水中的吸收量，吸水率为

式中：V初始为凝胶剂吸水前加入去离子水体积；V滤出水为凝胶剂吸水后滤出溶液体积；M凝胶剂质量为加入凝胶剂的质量；ρ为水的密度1.0 g/mL。

1.5 凝胶剂的保水性能分析

称取0.1 g各凝胶剂粉末于300 mL烧杯中，加入100 g去离子水，配制成质量浓度为0.1 g/100 mL的凝胶剂溶液。将直径为7 cm的中速滤纸浸渍于各凝胶溶液中1 min，待干燥后，分别放于各平皿内，称重(m1)。向各皿内的滤纸片上分别滴加1 g去离子水，平皿上覆盖一层保鲜膜，放入37℃恒温培养箱中，每隔4 h测定一次(m2)。以保水百分率对时间作图，保水率为

2 结果与讨论

2.1 不同凝胶剂对吸水率和保水性性能的影响

实验选取常用凝胶剂琼脂、PEG、黄原胶、瓜尔豆胶、卡拉胶、聚丙烯酸钠、层析硅胶。通过吸水率和保水性实验来考察凝胶剂的性能，实验结果如图2和图3所示。

由图2可以看出，聚丙烯酸钠的吸水量达到388.00g/g，黄原胶为40.70 g/g，瓜尔豆胶为39.60 g/g，而PEG、卡拉胶、琼脂、层析硅胶的吸水量仅分别为12.25，16.30，17.05，19.85 g/g。聚丙烯酸钠的吸水量是常用凝胶剂琼脂的20多倍，能比琼脂吸附更多的检测片浸液溶质，在检测时又能辅助检测片吸附检样。

图2 各凝胶剂吸水量对比

由图3可以看出，含有0.1 g不同凝胶剂的浸渍检测片放置于37℃恒温培养箱中，放置16 h后，含聚丙烯酸钠的保水率为52.71%，空白组为25.25%，24 h后，含聚丙烯酸钠的保水率为23.65%，而空白组的保水率已降至0。聚丙烯酸钠对检测片的保水效果最好，检测常用的凝胶剂琼脂在短时间内对检测片有一定的保水作用，至16 h时为39.40%，24 h后水分基本蒸发完全。相对于空白组，PEG、黄原胶、卡拉胶、聚丙烯酸钠、层析硅胶等使检测片的保水率均有不同程度的提高。结合各凝胶剂对检测片的吸水量和保水率的影响，聚丙烯酸钠具有相对优势，替代琼脂为本研制检测片所用凝胶剂。

图3 各凝胶剂对检测片保水性能的影响

2.2 缓冲剂浓度对培养基pH值和检测片显色灵敏度的影响

缓冲剂磷酸氢二钾具有调节培养基pH值和缓冲检样pH值变化的双重作用。实验选取磷酸氢二钾作为缓冲剂，配制两组系列质量浓度，一组为0～1.0 g/100 mL系列质量浓度；另一组为1.0～2.5 g/100 mL系列质量浓度。115℃灭菌15 min，加入已灭菌的TTC，浸渍纸片，待干燥后，分别滴加1 mL含10～102mL-1大肠杆菌的模拟鲜乳样和酸乳于检测片上，观察对检样的缓冲效果，同时测定磷酸氢二钾各浓度下的浸渍液pH值，实验结果如图4和图5所示。

由图4中看出，当缓冲剂质量浓度小于0.4 g/100mL时，随着磷酸氢二钾质量浓度的增加，检测片检出的菌落数有明显增加，质量浓度达到0.4 g/100 mL时，检出的菌落数最多，此时pH值为7.112，继续增加缓冲剂浓度，检测片上可观察的黄斑菌落数略有减少。由于溴甲酚紫的变色pH值范围为5.2～6.8，而含有质量浓度为0.2 g/100 mL磷酸氢二钾的培养基灭菌后pH值为6.693，仍处在溴甲酚紫的变色范围内，故检测片的显色效果欠佳。当缓冲剂质量浓度为0.4 g/100 mL时，pH值接近指示剂的变色pH临界值，且检测片显色效果良好，此时检测片的灵敏度相对较高，虽然添加高于此质量浓度的缓冲剂，检测片的显色效果良好，但不利于产酸能力弱的大肠菌群的检出，降低了检测片的灵敏度。

图4 不同质量浓度磷酸氢二钾对灵敏度的影响

乳品中的酸奶成弱酸性，检测片在检测酸奶样品时，缓冲剂需要发挥对检样的缓冲作用。由图5可看出，缓冲剂各质量浓度下检测片呈现的缓冲效果。在质量浓度为1.0 g/100 mL和1.5 g/100 mL时，缓冲剂的缓冲作用失效，检测片滴加酸奶检样立即变黄；2.0g/100 mL时检测片局部微黄，经几分钟缓冲作用后检测片又为蓝紫色。当缓冲剂质量浓度为2.5 g/100 mL时，缓冲效果明显，加样前后检测片均呈蓝紫色，且培养后的菌斑清晰可见。图5中，（a）的pH值为7.342；（b）的pH值为7.365；（c）的pH值为7.412；（d）的pH值为7.447。

图5 磷酸氢二钾用量对酸奶检样的缓冲效果

2.3 TTC 浓度对显色效果的影响

分别加灭菌后质量浓度为2 g/100 mL的TTC 0.05，0.1，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40 mL于50 mL改良浸液培养基中，混匀后浸泡纸片，干燥后接种大肠杆菌稀释液，37℃培养16 h后观察菌落显色效果，结果如表1所示。

由表1可以看出，当浸渍液中加入0.05 mLTTC时，大肠杆菌在检测片上生长，菌落几乎不着色；TTC加入量为0.1 mL和0.15 mL时，检测片上的菌落成微红色；0.20 mL时部分菌落显色清晰，部分微红色；而0.25～0.40 mL时，菌落均显红色，易于观察计数，但随着TTC用量的提高，大肠杆菌的生长略微受到抑制，因此TTC用量以0.25 mL为宜。

表1 不同质量分数TTC的显色效果

2.4 检测片基质组成优化

检测片基质在加入质量浓度为1.6 g/100mL溴甲酚紫0.2 mL的情况下，通过单因素试验选取胰蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、SDS、TTC、氯化钠、聚丙烯酸钠等7个因素，分别取3个水平，采用L18（37）正交实验，实验设计如表2所示，每组3个平行实验。

表2 浸液配方的因素水平

实验结果采用直观分析法，18次实验的菌落计数结果如表3所示。由表3可以看出，浸液配方中主要成分对于大肠菌群测定的影响顺序为：SDS＞胰蛋白胨＞磷酸氢二钾=TTC＞聚丙烯酸钠＞氯化钠＞乳糖，正交实验的优化组合为A1B1C2D1E2F1G1或A1B1C2D1E2F1G2。实验数据的方差分析结果如表4所示。由表4可以看出，抑菌剂SDS（D）对实验的影响显著，因此，抑菌剂用量应该严格按控量添加，这对于检测片大肠菌群正常生长和有效抑制非大肠菌群的干扰非常重要。

2.5 检测片性能与常规方法的比较

选择精确定浓的大肠杆菌菌悬液，采用本研究检测片与食品中总大肠菌群检测方法中的多管发酵检测法、平板法进行检测性能比较，考察它们的检出限、重复性、报告时间、检测步骤繁简性、检测成本等关键性能指标，实验比较结果如表5所示。

由表5中可以看出，检测片的检出限、重复性、报告时间、检测步骤繁简性、检测成本等关键性能指标优于目前常用的多管发酵检测法和平板检测法。

2.6 快速检测片的商品检测应用效果

实验在市场中随机取样鲜乳、酸乳、奶粉各20份，分别用研制的快速检测片和国标法进行大肠菌群含量检测，分析结果如表6所示。

由表6可以看出，快速检测片法与国标法对样品中大肠菌群的检测报告结果总符合率为96.7%，其中检测片法和国标法各检出2份阳性样品。对两种方法检出的阳性与阴性样品数进行χ2检验分析，快速检测片法和国标法在统计学上无显著性差异（P＞0.05）。

表3 正交实验结果

表4 方差分析

3 结束语

（1）凝胶剂一直作为微生物培养基载体被广泛应用。聚丙烯酸钠对微生物无毒害作用[11]，常温下可溶于水，具有超强的吸水能力和良好的保水性能。能有效地吸附检样，保障菌群生长环境中必须的水分。检测片浸渍液凝胶剂常温下不易凝固，简化了浸液维持温度条件的操作，解决了不加琼脂的浸液不能稳定均匀地固定于基片的缺点。

表5 3种方法检验的关键指标比较

表6 检测片法和国标法检测乳品中大肠菌群结果比较

（2）磷酸氢二钾缓冲剂在配制培养基时具有调节pH值的作用，在接种检样时，具有对检样酸环境变化的缓冲作用。使检测片接种酸性检样时指示剂依然能够有效显示。检测片用于鲜乳或奶粉样品检测时，培养基加入质量浓度为0.4 g/100 mL磷酸氢二钾为宜；检测酸奶时，加入质量浓度为2.0 g/100 mL磷酸氢二钾可达到对检样的缓冲和提高检测灵敏度。

（3）TTC是一种氢受体，在大肠菌群生长过程中产生的琥珀酸脱氢酶作用下，TTC将氢（H）还原成红色不溶性的甲賛，使菌落着色成红色。因此TTC的添加可避免乳品检样基质特性对检测的干扰。大肠菌群检测片培养基中每50 mL加入质量浓度为2 g/100 mL的TTC溶液0.25 mL，检测菌落显色效果较好。当TTC用量过少时，检测片上菌落着色浅或无，用量过多时又会对大肠菌群的生长产生抑制作用。

（4）本检测片法结果的报告形式，适用现行食品标准中规定的食品微生物学大肠菌群的测定和大肠菌群的计数，能以多片检测片代替国标中的多管发酵，具有与国标法相同的灵敏性，且操作简单，准确性高，检测时间只需16～18 h，比国标法的72 h缩短了54 h，检测效率得到明显提高。

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Rapid detection of coliforms in dairy using test strip

DUAN Xue-hui，WEI Bin，FU Qi，GUO Bing-qi，JIA Kui-yan
(State Key Laboratory of Food Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

In this study,a rapid and simple method for detection the total coliforms in dairy,fixing optimal nutrient including basic nutrition and supplementary nutrition,indicating agent,buffering agent,specific bacteriostatic agent on the designed strip through cold gel was investigated.Based on strip color change,coliforms can be quantitatively reported as MPN,and the overall assay time only needed of 16-18 hours.The conditions of the detection such as the species of cold gel and proportion of medium,as well as the concentration of indicating agent and buffering agent were studied.This method was compared to the multiple-tube fermentation using calibration of standard strain for the analysis of samples,the rapid test strip showed low detection limit of 0-4 cfu/mL.A high agreement(96.7%)was found between rapid test strip and standard on 60 commercial dairy samples.No significant difference(p＞0.05)was found between the detection results for the methods.The test strip method was cost-effective,simple,rapid and accurate,can be used to detect coliforms in dairy.

dariy;coliform bacreria;rapid test strip

TS252.7

A

1001-2230（2011）01-0038-04

2010-10-12

段学辉(1958-)，男，教授，从事食品生物技术方向研究。