奶山羊乳腺组织中基因CCDC85B的克隆

赵婧，闫宏博，孙瑞秋，李庆章，高学军

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

奶山羊乳腺组织中基因CCDC85B的克隆

赵婧，闫宏博，孙瑞秋，李庆章，高学军

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

克隆奶山羊乳腺中基因CCDC85B。从本实验室前期建立的基因文库中挑选出CCDC85B的17 bp标签，采用GLGI和RACE技术进行扩增，获得基因的全长。结果表明，扩增片段长度为1 282 bp序列，其中编码区为606 bp，编码202个氨基酸残基，BLAST比对结果显示，该序列与已知牛、人CCDC85B的同源性分别为100%和83%，证明此基因确为奶山羊乳腺组织中的CCDC85B，为该基因的进一步结构分析和功能研究奠定基础。

奶山羊；乳腺；CCDC85B；GLGI；RACE

0 引言

cDNA末端快速扩增技术以mRNA为模板，反转录合成cDNA的第一条链。然后用PCR扩增出从某个特定位点到3’端或5’端之间的未知核苷酸序列，该方法也被称为锚定PCR（anchored PCR)[1]或单边PCR（one-side PCR)[2]。如要研究同一基因家族的不同成员，可设计简并引物[3-8]。

GLGI技术是将包括17bp的LongSAGE标签和单一碱基dA、dC或dG与oligo-dT结合的锚定引物进行2次PCR扩增，最终得到的是含有SAGE标签的长片段DNA扩增产物[9,10]。

CCDC85B基因是一个含有85B的螺旋结构域，参考国内外资料，其可能对脂细胞分化有影响，负向调节有丝分裂的克隆扩增，但具体在动物乳腺中的研究尚无报道。本实验结合了RACE和GLGI两种技术，成功地克隆出CCDC85B在奶山羊乳腺中的全长序列，为深入地进行基因结构分析和研究该基因的生物学功能奠定基础。

1 材料

健康关中奶山羊泌乳期乳腺组织（本实验室冻存的组织样）；克隆载体pMD18-T，dNTP，各种DNA Marker，限制性内切酶SalⅠ，HindⅢ，KpnⅠ和LATaq DNA聚合酶（均购自大连莲宝生物公司）；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒（均购自AXYGEN公司）；Trizol（购自Invitrogene公司）；SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（购自Invitrogene公司）。

2 方法

从奶山羊乳腺组织中用Trizol法提取RNA，用逆转录酶MMLV反转录成cDNA，-20℃中保存。

2.1 SAGE-tag和GLGI分析

通用引物UPM为SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）中提供；特异性引物GSP1为本实验室前期建立的Long-SAGE基因库中获取的CCDC85B标签前面加上CATG作为粘性末端。

引物序列如下：

UPM：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'

GSP1：5'-CATGCAGGAGGTGAATCGGCA-3'

经过一次PCR扩增，将目的条带纯化，再与T载体连接后，转化感受态细胞，筛选并鉴定阳性重组子后，测序。

2.2 5'RACE

重新设计并合成引物，序列如下：

GSP2：5'-CTGTGCCCTCAATCATCTGGGGA-3'

UPM:5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'

经PCR扩增后，步骤同1.2.1。

2.3 序列的拼接及基因全长的获得

将2.1以及2.2 PCR扩增的结果进行拼接，从而获得全长序列。利用3’和5’末端信息设计引物，以5’-RACE-ready cDNA为模板进行扩增，通过长距离（LD）PCR获得全长序列。

3 结果与分析

3.1 总RNA的含量和纯度鉴定

3.1.1 总RNA含量和纯度的紫外分光测定

提取的总RNA经紫外分光光度计测得的OD260/OD280分别为1.93，OD260/OD280比值在1.8～2.0范围内，表明无蛋白质、基因组DNA污染。

3.1.2 总RNA1.8%琼脂糖凝胶电泳分析

总RNA经1.8%琼脂糖凝胶电泳后可见两条主带28S和18S，且两条主带的亮度28S︰18S约为2︰1，隐约可见溴酚蓝前面有一条很浅的条带5S,说明提取的总RNA完整，未出现降解，可进行后续的实验研究。

3.2 GLGI的结果

见有350 bp左右的条带（图1），胶回收后与pMD-T载体连接过夜，再连接感受态细胞后，进行阳性重组子的筛选，挑取单菌落摇菌6～8 h后提取质粒，质粒验证结果见条带与PCR胶回收条带大小一致（图2）。

图1 GLGI PCR扩增结果

3.3 5’RACE结果

见有900 bp左右的条带（图3），胶回收后与pMD-T载体连接过夜，再连接感受态细胞后，进行阳性重组子的筛选，挑取单菌落摇菌6～8 h后提取质粒，质粒验证结果见条带与PCR胶回收条带大小一致（图4）。

3.4 基因全长的获得

将3.2及3.3的结果进行拼接后，重新设计引物合成CCDC85B的全长，PCR的结果及质粒PCR验证的结果如图5和图6所示。并使用SalⅠ做单酶切，用HindⅢ和KpnⅠ做双酶切，结果如图7所示。

将验证后的质粒测序后，得到的序列如下（1 282 bp）：

BLAST同源性比对结果：（1）Bos taurus coiledcoil domain containing 85B（CCDC85B），mRNA，同源性为100%；（2）Homo sapiens coiled-coil domain containing 85B（CCDC85B），mRNA，同源性为83%。扩增片段长度为1 282 bp序列，其中编码区（438-1046）为606 bp，编码202个氨基酸残基。

4 结论

本实验从本课题组前期建立的Long-SAGE基因文库中，挑选出CCDC85B基因的17 bp标签作为基因特异性引物，通过GLGI技术和RACE技术的结合，经过两次PCR和长距离（LD）PCR成功地克隆出奶山羊乳腺组织中的基因CCDC85B的全长。目前国内外尚无对乳腺此基因研究的报道，为进一步进行该基因结构分析和研究该基因的生物学功能奠定了基础。

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Amplification and cloning of CCDC85B sequence from mammary gland of dairy Goat

ZHAO Jing,YAN Hong-bo,SUN Rui-qiu,LI Qing-zhang,GAO Xue-jun
（Key Laboratory of Dairy Science Ministry of Education Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Cloning of CCDC85B sequence from mammary gland of dairy goat.The SAGE Tag was elongated by GLGI to several hundreds base pair of EST,and the full length gene sequence was obtained by 5’RACE.The sequence of gene CCDC85B contains 1282 bp nucleotides.The gene encodes 202 amino acid residues,and had the highest similarity with bos and,human,the percent identities being100%and 83%.The results showed that the gene CCDC85B was reliably gained,and established foundation for construction analysis and function study of the gene.

dairy Goat;mammary gland;CCDC85B;GLGI;RACE

Q78，TS252.1

A

1001-2230（2011）01-0012-03

2010-10-19

赵婧（1986-），女，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。

李庆章