苏木醇提物对树突状细胞IL-12 P40mRNA转录的影响

黑龙江省中医研究院（150036）张春戬 郑佳新 冯丽辉

苏木，豆科云实属，药用部位为其干燥心材。近年来，国内外一些研究表明，苏木具有抑制T淋巴细胞转化功能的作用。本研究通过观察苏木醇提物对（dendritic cell，DC）IL-12 P40mRNA转录的影响，在细胞分子水平阐述其调节免疫的作用机制。树突状细胞在体内分布广泛，是唯一能激活初始型T细胞的抗原提成细胞，能够调节和调控细胞免疫功能[1]。IL-12是近年来发现的一种异源二聚体分子，主要由树突状细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞对细菌、细菌产物及细胞内寄生物等发生反应而产生，是启动免疫杀伤最主要的细胞因子。

附图 对照组与各治疗组IL-12电泳图

1 材料与方法

1.1 动物及试剂动物 近交系BALB／c小鼠（16～20g），C57BM小鼠（20～25g），购于哈尔滨市兽研所。允许动物在无特殊病原体环境中随意进食标准的饲料和纯净水。

1.2 主要试剂 苏木醇提物，黑龙江省中医研究院制剂室提供；重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte.macrophage colony stimulating Factor，GM—CSF），购自美国Biosource公司；胎牛血清（Fetal calf serum，FCS）和RPMI l640培养基，购自美国Hyclone公司。

1.3 小鼠骨髓DC培养 DC细胞的分离培养及分组参照文献[2]方法，无菌条件下提取BALB／c小鼠胫骨和股骨骨髓细胞，红细胞裂解后配制成l×106／m1细胞悬液接种于6孔板中（1.5～2.5m1／孔），并在每孔中加入2m1含10%胎牛血清的RPMIl640培养基，最后加入GMCSF（终浓度为0.02mg／m1）和IL-4（500U／m1），培养7天。然后将GM-CSF诱导培养7天的骨髓来源DC细胞进行分组，采取不同处理：对照组不做任何处理；苏木醇提物高剂量组（20μg／m1）、中剂量组（10μ g／m1）、低剂量组（5μg／ml）。上述各组DC继续培养48 h后，收集悬液细胞。

1.4 电镜分析 将DC细胞悬液用PH7、0.1mol／LPBS洗涤后，1000r／min离心5min，4%戊二醛固定，PBS洗涤，制成悬液滴片，1%锇酸固定，梯度乙醇脱水，扫描电镜观察，摄片。

1.5 RT-PCR测定IL-12 P40mRNA的转录细胞总RNA的提取采用TRIzolR试剂，cDNA合成采用随机引物法，PCR扩增条件为 ：94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环。IL-12 P40序列及扩增片段长度5’-GGA TGC CCC TGG AGA AAT GG-3’5’AGG TGG AGG TCA GCT GGG AG-3’655bp。取IL-12 P40 得PCR产物5μl，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳（含0.5 μl/ml溴化乙锭）30min，紫外透射仪下观察结果并摄片。

1.6 统计学分析 应用SPSSl3.0软件对数据进行统计分析，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC的扫描电镜观察 成熟DC的形态极不规则，有管状斧状伪足，有球茎状、泡状等细胞突起，长短不一，且表面光滑，构成不规则的形态，细胞表面有折叠结构。

2.2 IL-12 P40mRNA的表达结果：IL-12mRNA 与β-actin像素值比值均大于对照组（P＜0.05），见附图。

3 讨论

苏木，功效主治闭经、痛经、产后恶露不尽、中风、痈疽疮毒等，是临床常用活血化瘀中草药。近年的研究表明，苏木除具有传统疗效外，还具有抗炎及免疫抑制作用。苏木水提物对HL-60（人早幼粒白血病细胞株）有较强的细胞毒作用；在体外有与雷公藤相似的抑制人B淋巴细胞增殖作用及较强的抗器官排斥反应作用[3]。其醇提物对人体肿瘤细胞HCT-8、KB有明显的抑制作用，能诱导细胞凋亡。

本研究中，将BALB／c小鼠胫骨和股骨骨髓细胞经GM-CSF诱导而来的DC细胞进行分组，用苏木醇提物处理，RT-PCR测定IL-12 P40mRNA的转录情况。结果表明，经给予苏木醇提物处理的DC能够分泌高水平的IL-12 P40，进而促使T细胞转化为杀伤性T细胞，提高T细胞的杀伤活性，找出苏木醇提物对DC的药物作用靶点之一，为进一步研究苏木的免疫调节作用，以及从中药中寻找具有明确免疫抑制作用和低副作用的免疫抑制剂打下了良好的基础。