胶束萃取-高效液相色谱法同时测定葛根粉中5种异黄酮

姜兰芳，周光明*，李艳艳

(发光与实时分析教育部重点实验室，西南大学化学化工学院，重庆 400715)

胶束萃取-高效液相色谱法同时测定葛根粉中5种异黄酮

姜兰芳，周光明*，李艳艳

(发光与实时分析教育部重点实验室，西南大学化学化工学院，重庆 400715)

目的：基于表面活性剂作为萃取剂，应用胶束萃取-反相高效液相色谱法测定葛根粉中葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素5种异黄酮的含量。方法：以非离子表面活性剂Triton X-114为萃取剂，采用Phenomenex C18色谱柱，甲醇-体积分数0.25%冰醋酸溶液为流动相，梯度洗脱，利用紫外检测器在250nm波长处进行检测。考察色谱测定条件，优化胶束萃取和浊点预富集参数。结果：采用3g/100mL Triton X-114表面活性剂，液固比为100:1(mL/g)，40℃超声萃取30min，所得的萃取率最大。在表面活性剂提取液中，加入一定量的氯化钠进行浊点预富集，可以提高萃取率和预富集因子。该方法的定性检测限范围是0.016～0.079μg/mL(RSN=3)，平均回收率为93.7%～98.86%，预富集因子平均值可达到12.5。结论：该方法简便快速、灵敏可靠、绿色环保，适用于葛根粉中葛根素等5种异黄酮成分含量的测定和产品质量控制。

胶束萃取；浊点萃取；Triton X-114表面活性剂；异黄酮；高效液相色谱

葛根为豆科植物野葛的干燥根[1]，是常用中药材，现代研究证实，葛根中的主要有效成分为葛根素等异黄酮类化合物，该类化合物具有抗氧化性，改善心、脑血液循环、扩张冠状动脉、降血压、降血糖之功效[2-3]。葛根又属于药食同源，也广泛地被应用于保健食品和食品中。有关葛根中葛根素等异黄酮的含量测定研究已有不少报道[4-8]，但对市售的葛根粉中葛根素含量测定报道不多，本实验针对葛根粉中葛根素等异黄酮的提取、预富集条件以及测试条件等进行优化，并采用高效液相色谱法对葛根粉样品进行定量分析。

测定中草药葛根样品中的异黄酮含量通常采用高效液相色谱法[4-8]、高效薄层色谱法[9]和红外光谱法[10]等，其样品前处理常采用液-液萃取法、索氏萃取法和固相萃取法，这些方法都使用大量的有机溶剂，费时耗力而且在蒸发浓缩过程中有部分被测物丢失。胶束萃取(micelle-mediated extraction，MME)和浊点萃取(cloud point extraction，CPE)预富集方法是近年来发展起来的一种特殊液液萃取分离技术，它是利用表面活性剂胶束水溶液的增溶性和浊点现象，改变实验参数引发相分离，可以使表面活性剂结合的疏水性物质与亲水性物质达到理想的分离效果，从而可以提高回收率和预富集因子。与上述传统前处理方法比较，该方法只需要一定浓度的表面活性剂，具有试剂用量小、环境友好、萃取效率高、操作简便等优点，已广泛应用于环境样品[11-15]、医药样品[16-17]和固体样品[18-22]的前处理中。

本实验拟以非离子表面活性剂Triton X-114为萃取剂，利用胶束萃取技术来提取、分离葛根粉中的葛根素等异黄酮类物质，应用反相高效液相色谱法(R PHPLC)分析测定其含量，以期为评价葛根粉这一药食资源的质量提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根粉 重庆市场。

葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素对照品 天津中新药业中药现代化技术工程中心；甲醇(分析纯) 成都市科龙化工试剂厂；冰乙酸(分析纯)重庆东方试剂厂；氯化钠、硫酸钠、碳酸钠(均为分析纯) 重庆北碚化学试剂厂；二次蒸馏水为实验室自制；Triton X-114 深圳美荷生物有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20AT液相色谱输液泵、SPD-20A紫外检测器、CTO-10AS柱温箱、LC-Slution色谱数据处理系统 日本Shimadzu公司；色谱柱为Phenomenex C18(150mm×4.6mm，5μm) 广州菲罗门科学仪器有限公司；0.45μm针头微孔滤膜过滤器 重庆钛新仪器有限公司；KH-3200B型超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；TGL-16G高速离心机 上海安亭科学仪器厂；SZ-2自动双重纯化水蒸馏器 上海沪西分析仪器；LIDA pH计 上海理达仪器厂；FA2004A型分析天平 上海精天电子仪器公司。

1.3 溶液的配制

对照品储备液：分别精密称取对照品葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素适量，加甲醇配制成葛根素273μg/mL、大豆苷100μg/mL、大豆苷元500μg/mL、染料木苷100μg/mL、染料木素160μg/mL的溶液，作为储备溶液，待用。

对照品混合溶液：精密吸取5种异黄酮储备液适量，用3g/100mL Triton X-114表面活性剂溶液配制成一系列浓度不同的对照品混合溶液，冰箱(4℃)内保存备用。

1.4 样品处理

胶束萃取：准确称量0.1g葛根粉样品，置15mL离心管中，加入10mL 3g/100mL Triton X-114水溶液摇匀后放入40℃超声水浴中超声萃取30min，萃取完成后3000r/min离心10min，将萃取上清液经0.45μm有机滤膜过滤后待用。

CPE富集：将上述萃取上清液转入10mL的离心管中，加入1.76g NaCl旋涡振荡1min后，置入55℃恒温水浴中平衡40min，3000r/min离心5min使两相分离，弃去上层水相，分取下层表面活性剂富集相，用甲醇定容到1.0mL来降低表面活性剂的黏度，经0.45μm有机滤膜过滤后供高效液相色谱分析。

1.5 色谱条件

Phenomenex C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相由体积分数0.25%冰乙酸和甲醇组成(A为体积分数0.25%冰乙酸，B为甲醇)，采用梯度洗脱，洗脱程序为：0～15min，15%～80% B；15～20min，80% B；20～22min，80%～15% B；体积流量：0.8mL/min；进样量：2 5μL；检测波长：25 0n m；柱温：20℃。

2 结果与分析

2.1 不同提取溶剂的比较

为考察Triton X-114表面活性剂的提取效果，在相同的条件下，分别研究甲醇、5 0%甲醇、乙醇、环己烷、丙酮和正己烷6种常用萃取剂与3g/100mL Triton X-114非离子表面活性剂对0.1g葛根粉中5种异黄酮提取含量的影响。结果表明采用3g/100mL Triton X-114为提取溶剂，获得的葛根异黄酮类物质的提取量均为最大。

2.2 胶束萃取参数的选择和优化

2.2.1 表面活性剂质量浓度的选择

分别考察质量浓度为1.5、3、4、6、12g/100mL的Triton X-114表面活性剂对葛根粉中异黄酮类物质的提取效果。结果表明3g/100mL Triton X-114表面剂提取效果最好，结果见图1。

图1 Triton X-114表面活性剂质量浓度对异黄酮提取效率的影响Fig.1 Chromatograms of standard isoflavonoids, surfactant and samples

2.2.2 液固比的选择

考察液固比为33.3:1、40:1、66.7:1、100:1、200:1(mL/g)的样品和表面活性剂混合液。结果表明液固比为100:1(mL/g)的葛根粉表面活性剂溶液提取效果较好。实验结果见图2。

图2 液固比对异黄酮提取效率的影响Fig.2 Effect of Triton X-114 surfactant concentration on extraction rate of isoflavonoids

2.2.3 萃取温度和时间的选择

公立高等院校作为财政拨款的事业单位，其预算是政府财政预算的重要组成部分，政府公共财政改革必将对高校事业发展产生比较大的影响，也给高校现行的预算编制带来不小的冲击。高校应该顺势而为，主动适应国家财政预算管理的改革节奏，建立跨年度预算平衡机制，因地制宜，适时运用滚动预算编制方法，编制与高校事业发展相适应的中长期预算。

为了在尽可能低的萃取温度和最短的时间内达到尽可能大的萃取率，按照实验方法研究不同温度和时间对提取含量的影响。超声提取温度4 0℃时，超声时间30min以上提取含量均为最大，实验中选择在40℃时超声提取30min。

2.3 CPE富集参数的选择和优化

葛根异黄酮通过胶束萃取后利用表面活性剂的浊点现象进行预富集来提高预富集因子和回收率。通常促使CPE预富集的方法有两种：一种是升高温度，使样品溶液的温度高于表面活性剂的浊点温度；另一种是通过加入电解质来促使两相的分离，电解质的加入增加了萃取环境的离子强度，可使水相密度增大，降低极性物质在水中的溶解性，更易于进入富集相，另一方面也会使表面活性剂的疏水性增强，促使两相分离[23]。为改善分析物在胶束萃取后的预富集效果，考察电解质种类和浓度、平衡温度和时间对CPE5种异黄酮回收率的影响。

2.3.1 电解质种类和浓度的影响

考察NaCl、Na2CO3和Na2SO43种电解质对上述表面活性剂萃取液的预富集效果。结果表明加入NaCl可以使表面活性剂富集相的体积更小，回收率最大。因此实验选择NaCl电解质作为修饰剂来增强离子强度。加入不同浓度的NaCl，考察离子强度对萃取率的影响。当NaCl浓度为0.3mol/L时，萃取率达到最大。

2.3.2 平衡温度的影响

当表面活性剂浓度一定时，温度达到浊点温度后，随着温度的升高萃取率逐渐增大，表面活性剂富集相体积减小。在保证萃取完全的前提下，应该采用尽可能低的平衡温度。不同平衡温度对5种异黄酮萃取率的影响见图3(NaCl浓度为0.3mol/L和平衡时间为20min)，结果表明，在55℃平衡温度下，萃取率达到最大值，因此实验选择在55℃作为CPE预富集的平衡温度。

图3 平衡温度对异黄酮类物质回收率的影响Fig.3 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of isoflavonoids

图4 平衡时间对异黄酮类物质回收率的影响Fig.4 Effect of equilibrium temperature on recovery rate of isoflavonoids

在0.3mol/L NaCl和平衡温度为55℃的条件下，研究平衡时间对葛根粉中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素回收率的影响见图4。结果表明，平衡时间为40min获得的5种异黄酮类物质的回收率均为最大。

2.4 分析方法的确认

2.4.1 方法专属性考察

对照品混合液按2.3节的方法操作，进样20μL，记录色谱见图5A；取空白3% Triton X-114表面活性剂10mL，按2.3节方法操作，进样20μL，记录色谱图5B；从图5B可以看出，表面活性剂水溶液的紫外吸收很弱，不干扰5种异黄酮的分析测定。从图5C和图5D比较可以得知表面活性剂通过CPE预富集可以使被测物达到较好的预富集效果。

图5 标准品、表面活性剂和样品色谱图Fig.5 Effect of equilibrium time on recovery rate of isoflavonoids

2.4.2 线性关系

将一系列质量浓度不同的对照品混合溶液按1.5节色谱条件注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，回归方程及线性范围见表1。在0.078～136μg/mL范围内质量浓度和峰面积呈较好的相关性，r＞0.9996，在信噪比RSN=3时，检出限在0.016～0.079μg/mL，在信噪比RSN=10时，定量限在0.054～0.260μg/mL。

表1 线性关系实验结果(n=5)Table 1 Linear relationship between peak area and the concentration of isoflavonoids (n=5)

2.4.3 精密度和重现性

精密吸取对照品混合溶液20μL，按选定的色谱条件连续进样5次，结果葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素对照品峰面积的RSD分别为0.94%、3.29%、2.69%、1.61%、2.02%、1.38%，表明仪器的精密度良好。精密称取同一批葛根粉样品5份，按1.4节方法制备样品溶液并进行HPLC测定，葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素峰面积的RSD(n=5)分别为3.34%、2.48%、0.74%、1.83%和1.76%，结果表明该方法重现性良好。

2.4.4 提取回收率和稳定性

精密称取已知含量的同一葛根粉样品0.1g，称定9份分成3组，每组准确加入不同量对照品混合液，按1.4节方法制备样品溶液，HPLC测定。葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的平均加标回收率为93.70%～98.86%，预富集因子平均值可达到12.5。测定结果见表2。

表2 5种异黄酮的加标回收率和RSD(n=3)Table 2 Recovery rates and relative standard deviations of 5 isoflavonoids in spiked samples

2.4.5 样品含量的测定

取3批葛根粉样品，依次按1.4节方法处理样品，按选定的色谱条件进样，测定含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果(n=3)Table 3 Contents of isoflavonoids in real samples determined by this method (n=3)mg/mL

3 结 论

本方法以非离子表面活性剂Triton X-114为溶剂对葛根粉中的葛根素等异黄酮类物质进行超声波提取，提取液利用表面活性剂的浊点现象来预富集浓缩，用高效液相色谱法进行测定，采用UV作为检测器，表面活性剂对被测物的紫外吸收无影响，能准确地对葛根粉中的葛根素等异黄酮类物质进行定性和定量分析，且检测线性范围较宽，精密度较好，具有操作简便、快速、安全、经济、选择性好及检出限低等优点。

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Simultaneous Determination of Isoflavonoids in Kudzu Powder by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Micelle-mediated Extraction

JIANG Lan-fang，ZHOU Guang-ming*，LI Yan-yan
(Key Laboratory on Luminescence and Real-time Analysis, Ministry of Education, School of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University, Chongqing 400715, China)

Objective: A reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) coupled with micelle-mediated extraction method was developed for the simultaneous determination of five isoflavonoids such as puerarin, daidzin, daidzein,genistin and genistein from kudzu powder. Methods: The non-ionic surfactant Triton X-114 was used as the extraction solvent.The chromatographic separation of samples was performed on a Phenomenex C18 column using methanol-0.25% glacial acetic acid as the mobile phase by means of gradient elution and a UV detector set at 250 nm was used for detection. The chromatographic conditions were explored to optimize the micelle-mediated extraction and enrichment of cloud points. Results: The highest extraction rate of isoflavonoids was achieved using 3 g/100 mL Triton X-114 as the surfactant for ultrasonic-assisted extraction at 40 ℃ for 30 min with a material/liquid ratio of 1: 100 (g/mL). Sodium chloride was added to the extract to improve extraction rate and cloud point enrichment. The limit of detection (LOD) of this developed method was in the range of 0.016－0.079μg/mL(RSN=3) with average recovery rates ranging between 93.7% and 98.86%. The enrichment factor was approximately 12.5.Conclusion: This developed method is characteristics of simple operation, low cost, high extraction efficiency and less pollution to environment, which is suitable for the quality control of five isoflavonoids in kudzu powder.

micelle-mediated extraction；cloud point extraction (CPE)；Triton X-114 surfactant；isoflavonoids；high performance liquid chromatography (HPLC)

R284.1

A

1002-6630(2011)06-0186-05

2010-05-25

科技部重大专项(2008ZX07315)；重庆市自然科学基金项目(CSTC2007BB5370)

姜兰芳(1983—)，女，硕士研究生，研究方向为色谱分析。E-mail：jianglf@swu.edu.cn

*通信作者：周光明(1964—)，男，教授，博士后，研究方向为色谱及其联用技术。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn