锦鲤弗氏柠檬酸杆菌的鉴定

陈翠珍，房 海，葛慕湘，王秀云

(河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛，066004)

锦鲤(Cyprinus carpio L．)在分类学上属鲤科，为亚热带和温带地区的淡水鱼类。因其体表漂亮的斑纹及优美的游姿很具观赏价值，我国人民从传统民俗就赋予它吉祥、幸福的象征。因此，越来越多地博得广大养鱼爱好者的喜爱，也是我国高效益出口创汇鱼种之一。由于其特定的水族箱或水池等养殖方式，常因环境因素等使一些疾病尤其是细菌引起的传染病时有发生，造成较严重的经济损失。

河北省秦皇岛市某宾馆水池养殖的观赏用锦鲤，于2005年6月发生病害并偶有病死鱼出现。病鱼主要表现鳞片脱落、体表出血等症状。经病原学检验，认为其为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)与弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的混合感染所致;同时还检出了可能作为参与者的吉氏库特氏菌(Kurthia gibsonll)和琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)［1，2］。笔者报告了2株弗氏柠檬酸杆菌的形态特征，主要理化性状及系统发育学、病原学意义，药物敏感性等方面的研究结果。

1 材料与方法

1．1 细菌分离与纯培养

取病鱼3尾及刚刚病死鱼2尾共5尾进行检验，均表现在体侧、鳍、头部有不同程度出血，其中3尾的肛门处有出血，鳞片较大面积脱落;剖检见有肠道臌气，肝脏肿大、质脆并有出血，均有不等量血样腹水，2尾的腹内有小的血块，腹壁内层肌肉出血。取其中刚刚病死2尾的肝组织为材料，先做抹片经革兰氏染色镜检细菌;再划线接种于普通营养琼脂培养基，28℃培养24 h做细菌分离;待分离细菌后，选取不同菌落的一定数量，分别移接于普通营养琼脂培养基斜面做成纯培养(28℃培养24 h)供鉴定用。

1．2 细菌鉴定

取上述纯培养菌，分别移接于普通营养琼脂斜面，置28℃条件下培养20 h后制备成涂片标本，经革兰氏染色镜检细菌形态;分别划线接种于普通营养琼脂、血液琼脂(家兔脱纤血体积分数为0．07的家兔脱纤血营养琼脂)检查菌落特征;分别接种于普通营养肉汤(管)中，置28℃培养24 h，检查液体培养的生长表现;分别移接于细菌鉴定的相应培养基进行氧化酶、H2O2酶、糖(醇和苷)类代谢、吲哚、MR试验、V－P反应、有机酸盐利用、H2S产生、硝酸盐还原等试验，较系统地测定其相应理化特性［3］。

1．3 16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析

取上述分离鉴定的1个菌株接种于LB肉汤中37℃培养16 h，按大连宝生物工程有限公司生产的“小量细菌基因组DNA抽提试剂盒(批号:DV810A)”所述方法提取DNA作为PCR模板DNA。

16S rRNA基因PCR扩增的两个引物分别为27F(正向引物):5′－AGA GTT TGA TC(C/A)TGG CTC AG－3′;1492R(反向引物):5′－GGT TAC CTT GTT ACG ACT T－3′。在 20 μL 反应体系中含有:无菌蒸馏水 14．4 μL，10 × PCR 缓冲液2 μL，1．5 mmol/L MgCl2 1．6 μL，4 × dNTP 混合物 0．4 μL，引物各0．2 μL，2．5×106U/L 的 Taq DNA 聚合酶0．2 μL，模板 DNA 1 μL。PCR 反应条件为:96 ℃预变性3 min，接94℃变性1 min，55℃复性1 min，72℃延伸2 min，30个循环后72℃温育6 min。PCR扩增产物经DNA纯化系统(Wizard PCR Preps，Promega)纯化后，由上海博亚生物工程技术公司进行基因序列测定。

将上述菌株的16S rRNA基因序列通过 NCBI的 Blast检索系统(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/Blast/)进行序列同源性分析，使用ClustalX1．83软件与从GenBank数据库中获得的细菌16S rRNA序列进行多序列匹配排列(Multiple Alignments)，采用邻接法(Neighbor joining method)构建系统发育树。

1．4 菌种归类判定

根据对细菌形态、理化特性的检验结果，主要依据《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology．9th ed》(1994)、Austin B 等《Bacterial Fish Pathogens:Disease of Farmed and Wild Fish》(1999)、《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology Volume 2》(2005)及有关资料［4～6］，并结合 16S rRNA 基因序列与系统发育学的结果，进行供试菌的种属判定。

1．5 人工感染试验

择上述分离并经鉴定菌的代表菌株，移接于普通营养肉汤管37℃培养18 h后，制备成3×1011CFU/L的菌悬液，经腹腔接种感染健康鲤鱼6尾(每尾0．3 mL)，同时设立接种无菌普通营养肉汤的对照鲤鱼4尾。接种后隔离饲养于水族箱中，观察其发病及死亡情况，对死亡鱼及时检查，同时进行细菌分离和对分离菌做相应的形态及理化特性等复核性检验。以被感染鱼发病或死亡并能重新分离回收到原感染菌为供试菌株的病原性判定指标，对照鱼应在观察期内正常存活。

1．6 药物敏感性测定

取经鉴定的纯培养菌株，采用常规琼脂扩散(K－B)法进行对常用抗菌类药物的敏感性测定，以抑菌圈直径大小作为敏感与耐药的判定指标［7］。

2 结 果

2．1 细菌分离与纯培养情况

在2尾鱼的肝组织中，均见有较多量革兰氏染色阴性杆菌，在其中1尾中还偶见革兰氏染色阳性杆菌。做细菌分离，结果分离到4种细菌的菌落(分别记作A，B，C，D)。其中A菌从2尾鱼中均分离到且呈优势态，经鉴定为维氏气单胞菌;C菌仅从其中1尾分离到几个菌落，经鉴定为吉氏库特氏菌;D菌从2尾均分离到，但仅有很少菌落，经鉴定为琼氏不动杆菌;B菌即为本次所鉴定的弗氏柠檬酸杆菌。该菌在普通营养琼脂平板上，菌落呈圆形光滑、边缘整齐、稍隆起、浅灰白色、半透明至不透明，培养24 h直径多在大约1．3 mm。取每尾鱼分离菌落各1个做纯培养共2株，按分离地、日期及株数编号为HC050630B－1，HC050630B－2。

2．2 分离菌的主要生物学性状及细菌种类

2．2．1 形态特征 2株纯培养菌形态特征一致，均为革兰氏染色阴性、杆状(有的近似球杆状)、散在、个别的成双、两端钝圆、无芽孢、大小多在0．5 ～0．8 μm ×1．0 ～1．8 μm 的细菌。

2．2．2 菌落特征 2株纯培养菌在普通营养琼脂上的菌落特征和生长情况，与从病料中直接分离的相一致，培养48 h的菌落直径约为1．8 mm;在血液营养琼脂上的与在普通营养琼脂上的相同，不溶血。

2．2．3 在普通营养肉汤中的生长情况 在普通营养肉汤中，2株菌生长表现一致，均呈均匀混浊生长，管底有少量絮状沉淀(摇动后即消散)，形成轻度菌环(摇动后易消散)。

2．2．4 理化特性 2株纯培养菌对所测项目结果一致(表1)。

2．2．5 16S rRNA基因序列和系统发育学 用HC050630B－1菌株所扩增的16S rRNA基因序列长度1 458 bp，在GenBank中登录号为EF669481。将HC050630B－1株的16S rRNA基因序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性检索，结果其与柠檬酸杆菌属(Citrobacter)细菌的16S rRNA基因序列自然聚类，在检索出的柠檬酸杆菌属细菌序列中，该菌株与它们的同源性在99%。选取了其中19株细菌的16S rRNA基因序列进行系统发育学分析，结果其与弗氏柠檬酸杆菌聚为一分支，系统发育树如图1所示。

表1 2株分离菌的理化特性

2．3 人工感染的致病作用

择上述鉴定的弗氏柠檬酸杆菌HC050630B－1株，对健康鲤鱼的感染试验。结果供试6尾鱼感染后96 h和120 h各死亡1尾，剖检见肝脏不同程度的肿胀、腹腔内有血样腹水、肠管充血或有出血，其余4尾观察14 d未见发病;对照4尾观察14 d均正常存活。

取其中1尾感染死亡鱼的肝组织做细菌分离与检验，结果分离到原感染菌。

2．2．6 细菌种类 上述检验结果表明，所分离鉴定的2株菌为同种细菌。依据其形态与培养特性、理化特性及系统发育学的结果，判定为柠檬酸杆菌属的弗氏柠檬酸杆菌。

图1 16S rRNA基因序列分析聚类图

2．4 药物敏感性

取上述经鉴定的弗氏柠檬酸杆菌HC050630B－1菌株，做对37种抗菌类药物的敏感性测定。结果表现对供试的头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、氨曲南、阿奇霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、大观霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、氯霉素、恩诺沙星、复方新诺明、甲氧苄啶等21种药物呈现高度敏感或敏感(抑菌圈直径在16～28 mm)，对头孢唑啉、头孢拉啶、多黏菌素B、呋喃唑酮、呋喃妥因等5种呈低度敏感(抑菌圈直径在10～14 mm);对四环素、多西霉素、青霉素G、氨苄青霉素、苯唑青霉素、利福平、红霉素、克林霉素、万古霉素、新生霉素、杆菌肽等11种耐药(无抑菌圈形成)。

3 讨 论

由弗氏柠檬酸杆菌引起的水产动物病害已有较多报道，如舒新华等［8］报道了养殖乌鳢由该菌引起的腹水病，陈翠珍等［9］、李华等［10］报道了该菌引起的中华绒螯蟹感染，Sato等［11］报道了该菌引起水族箱养殖的翻车鲀(Sunfish，Mola mola)感染发病，Baya［12］报道该菌在西班牙引起大西洋鲑感染发病，Sanz［13］报道在美国由该菌引起的虹鳟感染发病。在锦鲤的细菌性感染方面，李焕荣等［14］报道由嗜水气单胞菌引起的锦鲤发病，病鱼主要表现鳞片脱落、肛门红肿，内脏色黄质脆、肠粘膜充血等症状;莫介化等［15］报道由温和气单胞菌引起的锦鲤出血症;陆小萏等［16］从患病锦鲤分离到摩氏摩根氏菌;Asutin B等［17］报道曾从发病锦鲤分离到米氏链球菌等，由弗氏柠檬酸杆菌引起的锦鲤感染发病尚少有报道。

本次所检锦鲤病例，缺乏特征性的临床表现及剖检变化，病鱼主要表现食欲减退、游动缓慢，鳞片脱落，体表充血及出血等;剖检所见肝、肾肿胀、出血等败血症变化。经做细菌检验，认为是一种细菌性混合感染症，其中主要是维氏气单胞菌，其次为弗氏柠檬酸杆菌;吉氏库特氏菌和琼氏不动杆菌缺乏明显的病原学意义。另一方面，经对健康鲤鱼所做人工感染试验，表明所检出的弗氏柠檬酸杆菌具有一定的致病作用，可单独引起感染鲤鱼的发病与死亡，并从感染死亡鱼中重新分离到原感染菌，也初步表明了该菌在所检锦鲤病例中的相应病原学意义，并认为该菌单独也可能会引起锦鲤感染发病。

本次经以37种抗菌类药物对分离菌的药敏测定，其结果有助于选择用药防治，同时亦可供对弗氏柠檬酸杆菌耐药谱等研究的参考。

［1］陈翠珍，张晓君，房海，等．锦鲤中琼氏不动杆菌的分离与鉴定［J］．水生态学杂志，2009，2(1):86－90．

［2］陈翠珍，房海，张晓君，等．锦鲤中吉氏库特菌的分离与鉴定［J］．微生物学杂志，2010，30(1):1－5．

［3］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［M］．北京:科学出版社，2001．

［4］HOLT J G，KRIEG N R，SNEATH P H A，et al．Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology［M］．9th ed．Baltimore:Williams and Wilkins，1994．

［5］AUSTIN B，AUSTIN D A．Bacterial Fish Pathogens:Disease of Farmed and Wild Fish［M］．Third Rev ed．Chichester，UK:Praxis Publishing Ltd，1999．

［6］GARRITY G M．Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology［M］．Second ed．Volume Two．New York:Part B Springer，2005．

［7］叶应妩，王毓三．全国临床检验操作规程［M］．2版．南京:东南大学出版社，1997．

［8］舒新华，金燮理，肖克宇，等．乌鳢腹水病病原的分离和鉴定［J］．湖南农业大学学报，1998，2(4):286－290．

［9］陈翠珍，张晓君，房海，等．中华绒螯蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的鉴定［J］．中国人兽共患病学报，2006，22(2):136－141．

［10］李华，刑殿楼，白国福，等．弗氏柠檬酸杆菌对河蟹致病性的研究［J］．水生生物学报，2001，25(3):217－223．

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［14］李焕荣，崔德凤，张耳，等．锦鲤致病性嗜水气单胞菌分离和药敏试验［J］．中国预防兽医学报，2002，24(3):205－208．

［15］莫介化，李春枝，张邦杰，等．锦鲤爆发性出血症病源的研究［J］．水产科技情报，2002，29(6):280－283．

［16］陆小萏，邹伟民，谭爱萍，等．锦鲤摩氏摩根氏菌的鉴定及致病性研究［J］．淡水渔业，2005，35(2):3－5．

［17］AUSTIN B，ROBERTSON P A W．Recovery of Streptococcus milleri from ulcerated koi carp(Cyprinus carpio L．)in the UK［J］．Bulletin of the European Association of Fish pathologists，1993，13:207－209．