山药中降糖活性成分的筛选与比较

何凤玲，叶小利，李学刚，*，李晓芳，浦 东，李 平，王小华，冯 平

(1.西南大学药学院，重庆400716;2.西南大学生命科学学院，重庆400715;3.北碚区中医院，重庆400700)

山药中降糖活性成分的筛选与比较

何凤玲1，叶小利2，李学刚1，*，李晓芳1，浦 东1，李 平3，王小华3，冯 平3

(1.西南大学药学院，重庆400716;2.西南大学生命科学学院，重庆400715;3.北碚区中医院，重庆400700)

目的:研究山药中多糖、皂苷、黄酮粗提物对HepG2细胞的葡萄糖的消耗作用，对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的降糖作用，以此来综合比较三种成分的降糖效果。方法:山药乙醇提取物经(D101)大孔树脂柱吸附乙醇梯度洗脱、分离纯化得到50%含量的总黄酮和60%含量的总皂苷，山药水提物纯化得到多糖，然后分别以HepG2细胞、糖尿病小鼠为模型研究了三种成分的降血糖效果。结论:皂苷可增加单位细胞的葡萄糖消耗量，呈现剂量依赖性。山药原粉、皂苷和黄酮能显著降低糖尿病小鼠的饮水量和血糖水平，其中原粉最明显。推测在山药的降血糖作用中三种成分存在协同效应。

山药多糖，山药皂苷，山药黄酮，HepG2细胞，糖尿病

山药(dioscoreae rhizoma)为薯蓣科(Dioscorea spp.)植物薯蓣的干燥根茎，性平、味甘，有健脾除湿、补气益肾等功效。山药频繁地出现在治疗“消渴病”的经典名方中，可见山药有治疗糖尿病的功效，张忠全等人研究发现山药多糖能提高血液中的C肽，具有改善受损的胰岛B细胞功能［1］。高洪武发现山药中的甾体皂苷对α－葡萄糖苷酶有抑制作用，可以降低四氧嘧啶小鼠的血糖水平［2］。张婧萱等人通过实验证明淮山药中的黄酮对Fenton体系产生的·OH有很好的清除作用［3］，并没有研究表明山药黄酮有降糖作用。为了促进山药资源的综合利用，本文以HepG2细胞和糖尿病小鼠为模型，系统地研究山药中多糖、黄酮、皂苷等三种成分的降糖活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

怀山药 重庆中药研究所鉴定为怀山药;HepG2细胞株 第三军医大学现代高血压研究所;特级胎牛血清 Gibco公司;RPMI－1640细胞培养基、葡萄糖酶法测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;四甲基偶氮唑盐(MTT) Sigma;其他试剂 均为分析纯。

二氧化碳培养箱 上海跃进医疗仪器厂;全自动酶标读数仪 美国伯乐公司;EOS BRAVO全自动生化分析仪 上海安泰分析仪器有限公司;旋转蒸发仪 上海亚荣仪器有限公司;Hitachi U－1800型紫外分光光度计 日本Hitachi仪器公司。

表1 山药各成分对HepG2细胞增殖及降糖消耗的影响(x±s，n=3)

1.2 实验方法

1.2.1 山药浸膏的提取与分离 称取山药4kg，用95%乙醇按1∶5比例回流提取3次。合并提取液浓缩得浸膏;将山药浸膏溶于水，通过大孔树酯，依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、100%乙醇进行洗脱。

1.2.2 山药总黄酮的纯化 将20%和40%组分的合并液烘干，水溶后上聚酰胺柱，分别用水、75%乙醇、100%乙醇洗脱，收集100%组分减压回收酒精。测定黄酮含量达70%左右［4］。

1.2.3 山药总皂苷的纯化 将80%的组分烘干，溶于95%乙醇，滴加过量的石油醚至刚好有沉淀析出为止，4℃静置过夜，离心弃上清液将沉淀烘干，测定皂苷含量达78%左右［5］。

1.2.4 山药总多糖的纯化［6］采用硫酸蒽酮法，葡萄糖为对照品。测定多糖含量为75%［7］。

1.2.5 HepG2的葡萄糖消耗实验及MTT实验［8］培养24h后更换分别含有不同浓度(0.0004、0.002、0.01mg/mL)的黄酮、皂苷、多糖、全浸膏的无血清培养基。每种浓度设置3复孔，设空白对照组。孵育24h后，取115μL培养基用葡萄糖试剂盒在全自动生化分析仪上检测葡萄糖残存量。剩下的培养基中加入15μL MTT，37℃ 孵育4h，加200μL DMSO，振荡10min，用酶标仪于490nm波长下检测吸光度。

1.2.6 糖尿病模型的建立［9］及分组处理 将小鼠分为6组，即空白组、山药原粉组、山药黄酮组、山药多糖组、山药皂苷组、高血糖组，每组10只。按中国药典(2010)规定人日常服用最大剂量换算成小鼠用量配制山药原粉，其余各成分换算成山药原粉中所含的同等剂量灌胃。空白组和高血糖小鼠组灌胃等量的蒸馏水。每日灌胃一次，同时记录饮水量、饮食量，连续15d，空腹血糖采集禁食12h后的小鼠尾静脉血测值。

1.2.7 统计分析 实验数据用SPSS13.0软件进行处理，结果用t检验，数值用x±s表示。

2 结果与分析

2.1 山药各成分对HepG2细胞增殖及降糖消耗的影响

见表1。

实验结果表明，与其他成分相比山药皂苷能明显增加培养基中HepG2细胞的葡萄糖的消耗量，同时对细胞增殖有抑制作用。扣除细胞增殖的抑制作用对培养基中葡萄糖消耗的影响，用MTT校正后，皂苷可显著增加单位细胞的葡萄糖消耗量。

2.2 山药各成分对糖尿病小鼠饮食量的影响

见表2。

表2 各成分组小鼠饮食量比较(n=10)

造模成功的糖尿病小鼠应该出现“多食”现象，但是从实验结果发现，与空白组比较，其他组的饮食量并没有增加，反而减少，其中相同时间下高血糖组进食量最少。

2.3 山药各成分对糖尿病小鼠饮水量的影响

见表3。

表3 各成分组小鼠饮水量比较(n=10)

结果表明，四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠相对空白正常小鼠会出现多饮现象，相比于高糖组，山药原粉组糖尿病小鼠的饮水量明显减少，其次山药皂苷组、山药黄酮组饮水量均有不同程度地减少。

2.4 山药各成分对糖尿病小鼠空腹血糖的影响

见表4。

结果表明，山药原粉组、黄酮组与空白组相比，差异无统计学意义(p>0.05)，山药多糖组、皂苷组、高糖组与空白组相比差异有统计学意义(p＜0.05)，给药后，各给药组血糖水平均有降低。与高血糖组比较，山药原粉组、黄酮组、皂苷组、黄酮组实验前差异无统计学意义(p>0.05)，实验后差异有统计学意义(p＜0.05)。

表4 山药各成分对糖尿病小鼠空腹血糖的影响(x±s，n=10)

3 讨论

山药作为一种药食两用性植物，含有丰富的化学组分［10］，其中对于降糖活性研究较多的山药多糖的降糖原理被认为是和增加胰岛素分泌、改善受损的胰岛 B细胞功能有关［11］。在检测HepG2细胞的葡萄糖消耗实验中，在相同浓度下皂苷相对于多糖、黄酮能显著促进HepG2对葡萄糖的消耗，并具有剂量依赖性。四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠实验中，山药原粉灌胃剂量参照中国药典(2010)人体日常服用最大剂量30g/kg换算成小鼠剂量4.5g/kg灌胃，分别检测山药浸膏中黄酮、皂苷、多糖的含量，根据已知山药浸膏率换算山药原粉中各成分的含量，再将已经纯化的各成分配制成4.5g山药原粉中所含的质量灌胃。实验中糖尿病小鼠普遍会出现的“三多一少”现象，结果发现皂苷组和黄酮组与高糖组相比，血糖水平明显降低，饮水量减少，比已知具有降糖活性的山药多糖效果更好。同时还发现山药原粉在降低血糖值和控制饮水量都比其它单个成分效果好，推测山药的降血糖作用可能是山药黄酮、山药皂苷、山药多糖协同作用的结果。

［1］张忠泉，陈百泉，等.山药多糖对大鼠血糖及胰岛释放影响的研究［J］.上海中医药杂志，2003，10(7):52－53.

［2］高忠武.山药甾体皂甙的分离提取及其在小鼠体内降糖活性研究［D］.上海大学硕士学位论文.

［3］张婧萱，廖保宁，等.淮山药中总黄酮的提取及对羟自由基的清除作用［J］.微量元素与健康研究，2007，24(1):44－54.

［4］冯志毅，赵献敏，等.卷柏总黄酮纯化工艺研究［J］.中成药，2009，31(4):544－546.

［5］洪艳平，尹忠平，等.山药总甾体皂苷提取与测定［J］.中国食品学报，2008，8(8):46－50.

［6］李义，李红霞，等.山药水溶性粗多糖提取工艺的研究［J］.饲料工业，2005，26(16):45－47.

［7］杜家方，张重义.不同品种怀山药总多糖含量与干物质积累分配比较［J］.江苏中医药，2008，40(8):57－59.

［8］汪宁，朱荃，等.桑寄生对培养的人HepG2细胞葡萄糖消耗作用的影响［J］.中医药学刊，2006，24(3):442－443.

［9］郜宏丽，等.山药多糖对糖尿病小鼠降血糖作用［J］.中国公共卫生，2006，22(7):804－805.

［10］赵宏，谢晓玲，等.山药的化学成分及药理研究进展［J］.今日药学，2009，19(3):49－51.

［11］胡国强，杨保华，等.山药多糖对大鼠血糖及胰岛释放的影响［J］.山东中医杂志，2004，4(4):230－231.

Study on filtration and comparison of hypoglycemic bioactive components in dioscoreae rhizome

HE Feng－ling1，YE Xiao－li2，LI Xue－gang1，*，LI Xiao－fang1，PU Dong1，LI Ping3，WANG Xiao－hua3，FENG Ping3
(1.College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400716，China;2.School of Life Science，Southwest University，Chongqing 400715，China;;3.Beibei traditional Chinese Medical Hospital，Chongqing 400700，China)

Objective:To study the effect of extracts of dioscorea rhizome－polysaccharides，saponins and flavones to HepG2 cell with the subject of consumption glucose affection and to hypoglycemic action effect to the diabetic mice model established intra－abdominal injection of alloxan in order to compare the three components’hypoglycemic bioactive.Methods:using the D101 macroporous resin adsorption process for the ethanol extracts of dioscoreae rhizome，elution with different concentration of ethanol.Depurating get 50%flavones content or so，and 60%saponins，and get polysaccharides from extracts of dioscoreae rhizome by water.Then use HepG2 cell and the diabetic mice as model to study three components hypoglycemic affections.Results:It demonstrated that saponins could lead to adding consumption of glucose in unit cell and make model dose－dependent.Dioscoreae rhizome，saponins and flavones could decrease the water drinking volume of diabetic mice and level of glucose.Dioscoreae rhizome was best.It concluded that three components showed synergistic effect among dioscoreae rhizome’s dhypoglycemic bioactive base on the experiment.

dioscoreae rhizome polysaccharides;dioscoreae rhizome saponins;dioscoreae rhizome flavones;HepG2 cell;diabetic

TS201.4

A

1002－0306(2011)06－0373－03

2010－07－15 *通讯联系人

何凤玲(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:化学与生物药物分析。

重庆市攻关项目(CSTC，2010AC5007);重庆市科委攻关项目(CSTC 2010AC5007)。