超高效液相色谱一串联四极杆质谱法测定苦荞麦中黄酮类化合物

李 欣，王步军

(中国农业科学院作物科学研究所/农业部谷物品质监督检验检测中心，北京100081)

超高效液相色谱一串联四极杆质谱法测定苦荞麦中黄酮类化合物

李 欣，王步军*

(中国农业科学院作物科学研究所/农业部谷物品质监督检验检测中心，北京100081)

建立苦荞麦中芦丁、槲皮素和山萘酚含量的超高效液相色谱－串联四级杆质谱联用仪(UPLC－MS－MS)测定方法。试样用甲醇超声波提取，HSSC18超高效液相色谱柱、甲醇－水(0.1%甲酸)流动相分离，以电喷雾离子源负离子检测方式进行质谱分析，多反应监测(MRM)定量。结果表明，在0.1～100μg/mL范围内，芦丁、槲皮素、山萘酚浓度与峰面积均有良好的线性关系，相关系数r2均大于0.99。在低、中、高3个浓度添加水平下，三种物质的回收率均在94%以上，相对标准偏差在2.19～12.54范围内。芦丁检出限为0.01ng/mL，槲皮素、山萘酚检出限为0.1ng/mL。

苦荞麦，超高效液相色谱－串联四极杆质谱，黄酮类化合物

苦荞麦俗称苦荞，学名鞑靼荞麦(Tartarian Buckwheat)，属双子叶蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum esculentum)植物，在我国西南山区如重庆、四川有广泛种植［1］。苦荞麦具有十分丰富的营养价值，其中的蛋白质、脂肪含量均高于小麦粉和大米;VB2含量高于大米、小麦粉2～10倍;钾、镁、铁明显高于大米、小麦粉;芦丁(VP)和叶绿素更是谷类作物所没有的。与甜荞相比，苦荞麦蛋白质高1.7倍，脂肪含量高1.6倍，VB2含量高1.7倍，VP含量高12～14倍［2］。苦荞麦所含营养成分当中，特别值得注意的是它所含有的其它禾谷类粮食中所没有的生物类黄酮物质。黄酮类化合物是一组存在于植物中的天然产物，属于植物次级代谢产物［3－4］，研究表明这些活性成分有防治心脑血管疾病、降低血脂、防治糖尿病等多种疗效［5－6］。本研究应用UPLC－MS－MS联用技术研究了苦荞麦中的黄酮类成分提取、分离和分析方法，目的是建立苦荞麦中芦丁、槲皮素和山萘酚的测定方法，为深入研究苦荞麦营养价值和产品开发服务。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦荞麦皮粉 购自西昌航飞苦荞麦开发中心;芦丁标准品 购于中国药品生物制品检定所;槲皮素和山萘酚标准品 购于北京益利生物制品有限公司，甲醇(色谱纯) 美国Fisher公司;甲酸 分析纯;水 超纯水。

ACQUITY Ultra Performance LC－Xevo TQ MS质谱仪 美国Waters公司，配有ESI源，Masslynx 4.1数据处理系统;超声波清洗器(昆山KQ－300DE) 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的制备

1.2.1.1 标准储备液的制备 称取芦丁对照品10mg(精确到0.0001g)，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得芦丁标准储备液(每1mL中含芦丁0.2mg);称 取 槲 皮 素 标 准 品 2.5mg(精 确 到0.00001g)，溶于100mL甲醇，即得槲皮素标准储备液(每1mL中含槲皮素25μg);称取山萘酚标准品0.5mg(精确到0.00001g)，溶于50mL甲醇，即得山萘酚标准储备液(每1mL中含山萘酚0.01mg)。

1.2.1.2 标准工作液的配制 用甲醇:0.1%甲酸水(90∶10)稀释标准储备液。

1.2.1.3 苦荞麦黄酮提取液的制备 称取苦荞麦粉1.0g(精确到0.001g)于50mL三角瓶中，加入30mL 80%甲醇，60℃进行超声提取30min，趁热减压抽滤，定容，取1mL滤液，用微孔滤膜(0.2μm)过滤。

由于样品中芦丁、槲皮素、山萘酚含量不同，测定时将黄酮提取液分别稀释为10000、100、10倍，用于测定芦丁、槲皮素和山萘酚。

1.2.2 分析条件

1.2.2.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱(2.1×50mm，粒径1.8μm);流动相甲醇(A)－水(0.1%甲酸)(B)梯度洗脱(见表1);柱温35℃;流速0.6mL/min;样品进样量10μL。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2.2 质谱条件 仪器采用负离子接口模式，毛细管电压2.0kV;离子源温度150℃;锥孔反吹气流量30L/h;脱溶剂气温度500℃;脱溶剂气流量1000L/h。应用Xevo TQ的IntelliStart技术建立相应的质谱方法(MRM)，分别进每个标准品选择最优条件。母离子和子离子的质量数和碰撞能量参数详见表2。

表2 质量条件参数

2 结果与讨论

2.1 色谱条件和质谱条件的选择

应用ACQUITY UPLC HSS C18柱，以甲醇－0.1%甲酸水溶液为流动相，流速0.60mL/min，每一次进样的分析时间为3.0min，芦丁、槲皮素、山萘酚出峰时间分别为1.19、1.68、1.83min。

芦丁 (C15H30O16)分子量为 610.52，槲皮素(C15H10O7)分子量为302.24，山萘酚(C15H10O6)分子量为286.24，其在ESI负离子模式下均具有较强的离子化效率，m/z 609.06、m/z 301.95、m/z 285.02分别是其准分子离子峰［M－H］－。对其进行子离子扫描得到碎片离子峰，分别选择丰度较高的两个特征离子m/z 300.15和271、m/z 150.91和178.98、m/z 187.45和92.85，对0.5ng/mL芦丁、槲皮素、山萘酚进行同时定性定量检测，其总离子流和定量离子流MRM图见图1。

图1 芦丁、槲皮素、山萘酚的MRM图

2.2 方法的线性关系考察

将配制好的芦丁、槲皮素、山萘酚标准储备液稀释为0.1、1、10、50、100μg/mL系列标准溶液，分别进样10μL，以峰面积y为纵坐标，质量浓度(x，μg/mL)为横坐标绘制工作曲线，回归方程分别为 Y=867.136X+57.0508，Y=132.72X+104.713，Y=1737.43X+11043.5。结果表明，在0.1～100μg/mL范围内，三种标准品浓度与峰面积有良好的线性关系，相关系数R2分别为0.999、0.999、0.990，线形关系如图2～图4。

图2 芦丁线性关系图

图3 槲皮素线性关系图

图4 山萘酚线性关系图

2.3 方法的检测限

实验确定芦丁检测限为 0.01ng/mL(S/N=25.90)，槲皮素检测限为0.1ng/mL(S/N=22.49)，山萘酚检测限为0.1ng/mL(S/N=61.30)。

2.4 方法的精密度

对同一黄酮提取液分别进行6次进样测定，其结果如表3所示。

表3 方法的精密度测定结果

从表3中可以看出，该方法的精密度很好。

2.5 方法的重复性

对苦荞麦样品按照1.2.1.3方法制备黄酮提取液5份，分别进样测定芦丁、槲皮素和山萘酚含量，结果如表4。

表4 重复性测定结果

表中结果表明，该方法的重复性较好。

2.6 回收率

以苦荞麦样品作为基质，分别对芦丁、槲皮素、山萘酚进行低、中、高三个水平添加回收实验，每个水平重复测定5次，各添加回收水平、平均回收率与精密度见表5。

表5 添加回收率结果(n=5)

2.7 实际样品的测定

应用本方法对11个苦荞麦品种进行芦丁、槲皮素、山萘酚含量的测定，测定结果见表6。

表6 样品中芦丁、槲皮素、山萘酚含量测定结果

环境因素对苦荞生物黄酮类物质含量有着十分重要的影响，这些环境因素主要包括海拔、光照、土壤、气候等，是形成不同品种苦荞生物类黄酮物质含量差异的重要因素［7－8］。测定结果与文献报道的高效液相色谱测定的数值较接近，表明超高效液相色谱－串联质谱方法能用来对苦荞麦中的芦丁、槲皮素、山萘酚进行含量测定。相对于HPLC法，具有更短的分析时间和更高的检测灵敏度。

3 结论

超高效液相色谱－串联质谱技术测定苦荞麦中芦丁、槲皮素和山萘酚含量，具有前处理方法简单、分析时间短、回收率稳定的特点，且电喷雾串联四极杆质谱的MRM扫描方式抗干扰强，使方法的灵敏度更高，选择性强，适用于同时进行定性定量快速测定苦荞麦中芦丁、槲皮素、山萘酚的含量。

［1］唐宇，王安虎.苦荞的成分功能研究与开发应用［J］.四川农业大学学报，2001，19(4):355－358.

［2］张振福，罗文森.苦荞麦的化学成分与特殊功能［J］.粮食与饲料工业，1998(2):40－41.

［3］Jianya Q，Dietmar M，Manfred K，et al.Flavonoids in fine buckwheat(Fagopyrum esculentum Mǒnch)flour and their free radicalscavenging activities［J］.Deutsche Lebensmittel－Rundschau，1999，95(9):343－349.

［4］Si－quanLi，et al.Advances in the development of functional foods from buckwheat［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2001，41(6):451－464.

［5］Mitsure W，et al.Antioxidant compounds from buckwheat(Fagopyrum esculentum Mǒnch)hulls［J］.Agric Food Chem，1997，45:1039－1044.

［6］Kathyn J Steadman，et al.Minerals，phytic acid，tannin and rutin in buckwheat seed milling fractions［J］.Sci Food and Agric，2001，81:1094－1100.

［7］唐宇，赵刚.荞麦中黄酮含量的研究［J］.四川农业大学学报，2001，19(4):353－354.

［8］张瑞，杨楠，等.苦荞核心种质芦丁含量测定及成因分析［J］.中国农学通报，2008，24(4):157－161.

Determination of flavonoids in tartary buckwheat by UPLC－MS－MS

LI Xin，WANG Bu－jun*
(Institute of Crop Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences/The Cereal Quality Supervision and Testing Center，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China)

The objective of this research was to establish a method for detecting Rutin，Quercetin and Kaempferol in tartary buckwheat by UPLC－MS－MS.Tartary buckwheat samples were extracted with methanol in a ultrasonic cleaner，and Rutin，Quercetin and Kaempferol were separated by a HSS C18UPLC column，with methanol－0.1%formic acid as mobile phase，electrospray ionization was applied and operated in the negative ion mode，then quantified with multiple reaction monitoring(MRM).Results:Good linearities were observed in the range from 0.1～100μg/mL，with correlation coefficients above 0.99.The mean recoveries of three levels were all above 94%and the relative standard derivations were between 2.19 and 12.54.The detection limit of Rutin，Quercetin and Kaempferol were 0.01，0.1，0.1ng/mL，respectively.

tartary buckwheat;UPLC－MS－MS;flavonoids

TS211.7

A

1002－0306(2011)04－0383－04

2010－03－30 *通讯联系人

李欣(1985－)，女，硕士研究生，研究方向:农产品质量安全与检测技术。