辅色对蓝靛果花色苷稳定性的影响

张 智，宋 静，王振宇，赵 鑫，王宇嘉

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040)

辅色对蓝靛果花色苷稳定性的影响

张 智，宋 静，王振宇*，赵 鑫，王宇嘉

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040)

天然色素的稳定性始终是制约其发展的瓶颈，以蓝靛果为原料，研究了添加酸、金属盐、糖类和氨基酸等辅色素对蓝靛果中花色苷稳定性的影响。结果表明，对羟基苯甲酸、水杨酸钠和甘氨酸的添加使得花色苷在吸收光谱中发生红移并产生增色效应，且在连续高温光照后保存率依然较高。通过单因素实验选取三者最佳浓度，然后采用三因素三水平响应面分析，依据回归分析确定最佳条件为:对羟基苯甲酸、水杨酸钠和甘氨酸添加的质量浓度分别为0.063%、0.041%和0.039%，测得蓝靛果花色苷保存率为88.01%，而不加辅色素保存率仅为48.97%，稳定性提高了1.8倍，为蓝靛果花色苷天然色素的应用和发展提供了有利条件，有一定的开发利用价值。

蓝靛果，花色苷，辅色素，稳定性，响应面

蓝靛果忍冬(Lonicera edulis Turcz)是忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物，落叶灌木，果实为浆果，果汁为鲜艳的深玫瑰色，含有丰富的营养物质，具有较高的保健及药用价值，特别是其活性成分花色苷，近年来倍受国内外研究人员的青睐［1－3］。花色苷是纤维素植物最重要的色素，安全无毒副作用，作为水溶性天然着色剂有着广泛的应用［4］。但作为天然色素，花色苷同样存在很多问题，一般情况下为水溶性，受pH影响会变色，对光、温度、氧等均敏感，其应用被限制在花色苷的相对不稳定性和低提取率上［5］。有研究表明，添加辅色素可以模拟植物体内生化环境，是提高花色苷稳定性的有效手段［6］。辅色素通常是无色的，但与花色苷溶液混合发生相互作用产生增色效应，并在吸收光谱中发生红移(紫外－可见光区域)。辅色素可以是黄酮、生物碱、氨基酸、有机酸、核苷酸、多糖、金属或者其它花色苷［7］。文中选用多种辅色素检测其对蓝靛果中花色苷稳定性的影响，从中选出稳定效果较好的辅色素，采用响应面设计方法，确定最佳配比，从而提高蓝靛果中花色苷的稳定性，拓展其应用范围。

表1 实验因素水平表

表2 酸类对蓝靛果花色苷稳定性的影响

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝靛果 采摘于大兴安岭;草酸、邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、结晶三氯化铝、水杨酸钠、硫酸锰、甘氨酸、盐酸羟胺、蔗糖等 均为国产分析纯。

HPG－280B光照培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;TU－1810PC紫外可见分光光度计北京普析通用仪器责任有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝靛果花色苷的制备 将蓝靛果清洗除杂，匀浆离心，通过大孔树脂AB－8初步纯化，真空旋转蒸发浓缩，4℃保存备用。

1.2.2 辅色素对蓝靛果花色苷稳定性的影响 花色苷是水溶性色素，根据比尔定律，溶液的浓度与其吸光度A成正比［8］，可用紫外－可见分光光度法测定总花色苷的含量。添加辅色素后稳定一段时间，在200～700nm扫描波长，随后通过连续光照和高温来检测添加辅色素对吸光值的影响，进而通过保存率得出辅色素对花色苷稳定的影响。

1.2.2.1 酸对蓝靛果花色苷稳定性的影响 吸取一定量的花色苷浓缩液加入到50mL的容量瓶中，分别配制质量浓度为1%的草酸、邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、三氯乙酸、水杨酸、冰乙酸、丁二酸、丁二酸酐溶液，取5mL加到容量瓶中，用蒸馏水定容，以不加酸的花色苷溶液为对照。

由于十四酸和月桂酸在水中的溶解度很低，取2mL乙醇萃取的蓝靛果花色苷浓缩液，用乙醇稀释至50mL，分别添加0.05g十四酸和月桂酸，以不加酸的花色苷溶液为对照。

1.2.2.2 金属盐对蓝靛果花色苷稳定性的影响 分别配制质量浓度为1%的乙酸锌、乙二胺四乙酸二钠、乙酸钠、无水氯化钡、水杨酸钠、无水氯化钙、硫酸锰溶液，取5mL加到装有一定量花色苷的50mL容量瓶中，用蒸馏水定容，以不加金属盐的花色苷溶液为对照。

1.2.2.3 其它辅色素对蓝靛果花色苷稳定性的影响

分别配制质量浓度为1%的甘氨酸、L－赖氨酸、L－酪氨酸、N－亚甲基双丙烯酰胺、盐酸羟胺、蔗糖、葡萄糖、D－果糖溶液，取5mL加到装有一定量花色苷的50mL容量瓶中，用蒸馏水定容，以不加金属盐的花色苷溶液为对照。

1.2.3 辅色素浓度对蓝靛果花色苷稳定性的影响选取稳定效果较好的辅色素，配制成质量浓度为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的花色苷溶液，比较在不同浓度下吸光值的大小，确定最佳浓度。

1.2.4 响应面法优化辅色素对花色苷稳定性的影响

在单因素实验的基础上，选择对花色苷稳定性影响较显著的对羟基苯甲酸、水杨酸钠和甘氨酸，通过Box－Behnken实验设计，以保存率为响应值，进行三因素三水平的响应面分析实验。

2 结果与讨论

2.1 酸对蓝靛果花色苷稳定性的影响

从表2可以看出，草酸对蓝靛果花色苷起到减色作用;邻苯二甲酸和对羟基苯甲酸的添加使得蓝靛果花色苷的最大吸收峰红移，吸光值增大;其余酸类对花色苷的稳定性也有不同程度的影响。在光照和高温的作用下，吸光值逐渐降低，在72h后对羟基苯甲酸的保存率最高，远远高于未添加的空白样，说明对羟基苯甲酸对提高蓝靛果花色苷的稳定性有较好效果，可以作为稳定条件进一步研究。

十四酸和月桂酸在乙醇提取的花色苷溶液中，添加和不添加的三组花色苷的最大吸收峰均为530nm，稳定并未提高，降低的趋势和空白样一致。

2.2 金属盐对蓝靛果花色苷稳定性的影响

从表3可以看出，金属盐的添加对花色苷的最大吸收峰和吸光值均有不同程度的影响。硫酸锰使得最大吸收峰红移的程度最大，但增色及稳定效果均不好;无水氯化钙使得最大吸收峰蓝移，吸光值及保存率有所提高;水杨酸钠使得最大吸收峰红移，吸光值增大，保存率远远高于空白组，对蓝靛果花色苷起到较好的稳定作用。

2.3 其它辅色素对蓝靛果花色苷稳定性的影响

从表4可知，糖类对花色苷的影响不显著，保存率并未有显著提高;氨基酸中，甘氨酸影响比较显著，最大吸收峰有红移，且稳定性有较大的提高;添加维生素B1的花色苷稳定性降低;添加两种胺类后，吸光值明显降低，对花色苷具有减色作用。

2.4 辅色素浓度对蓝靛果花色苷稳定性的影响

根据上述实验，选择对花色苷稳定性影响较大的辅色素对羟基苯甲酸、水杨酸钠和甘氨酸，进一步检测辅色素不同浓度对蓝靛果花色苷稳定性的影响。

表3 金属盐对蓝靛果花色苷稳定性的影响

表4 其它辅色素对蓝靛果花色苷稳定性的影响

由图1可知，开始随着对羟基苯甲酸浓度的增大，吸光值逐渐增大，浓度高于0.06%时，趋于稳定;甘氨酸在小于0.04%时吸光值逐渐增大，在高于0.04%时，略有降低随后又增大，但增大趋势不是很明显;随水杨酸钠浓度增大，吸光值也不断增大，0.04%时达到最大值。综合考虑，确定对羟基苯甲酸最佳浓度为0.06%，水杨酸钠和甘氨酸浓度均为0.04%。

图1 辅色素浓度对花色苷稳定性的影响

2.5 响应面法优化辅色素对花色苷稳定性的影响

2.5.1 响应面实验结果及回归模型的建立 采用MINITAB15软件中Box－Behnken设计，实验设计及结果如表5所示。

根据响应面实验数据进行二次多元回归拟合，建立以对羟基苯甲酸、水杨酸钠和甘氨酸浓度为自变量，以保存率为因变量的二次多元回归方程为:

2.5.2 回归模型的分析 对回归方程进行显著性分析和方差分析，结果如表6、表7所示。

表5 三因素三水平响应面实验设计及结果

表6 回归系数显著性分析

由表6回归系数显著性分析可知，此模型是极其显著的，一次项的显著性分别是X1>X3>X2，即各因素对花色苷稳定性的影响顺序为:对羟基苯甲酸>甘氨酸>水杨酸钠;二次项均比较显著;交互项X1X2和X2X3较为显著，X1X3交互作用不显著。由表7可知，模型P=0.000＜0.0001，表明回归模型极显著;失拟项P=0.083>0.05不显著，说明模型完全可以用来对实验进行拟合，不需要引入更高次数的项，校正复相关系数的平方R2=0.9890，说明二次回归方程的拟合程度较好，所以该模型可以用于保存率的理论预测。

表7 回归模型方差分析

2.5.3 响应曲面的分析 为了进一步描述因素变化与保存率之间的内在规律，通过将三因素X1、X2和X3固定一个变量(取0水平)进行降维分析，由此可对任意两因素之间交互作用对保存率的影响进行分析与评价。

图2～图4是三因素之间交互作用对保存率影响的曲面图，可以很直观地表现出影响的显著性。经比较可知，对羟基苯甲酸对保存率的影响最为显著，表现为曲线较陡;相比之下，水杨酸钠和甘氨酸曲线较缓和，影响较小。

图2 对羟基苯甲酸和水杨酸钠浓度对花色苷保存率影响的曲面图

图3 对羟基苯甲酸和甘氨酸浓度对花色苷保存率影响的曲面图

通过对二次回归方程求偏导，得到编码值X1=0.173、X2=0.066、X3=－0.055，在此值时，保存率为88.10%，相对应的实际值x1=0.063%、x2=0.041%、x3=0.039%。

2.5.4 验证实验 按照优化后的工艺参数进行验证实验:对羟基苯甲酸、水杨酸钠和甘氨酸添加的质量浓度分别为0.063%、0.041%和0.039%，以不加为空白，将各组放到光照培养箱中进行光照，72h后测定吸光值，计算保存率。添加辅色素的蓝靛果花色苷保存率为88.01%，空白组保存率为48.97%，稳定性提高了1.8倍。

图4 对水杨酸钠和甘氨酸浓度对花色苷保存率影响的曲面图

3 结论与讨论

实验结果表明，一些辅色素与蓝靛果中花色苷发生相互作用，使得花色苷的最大吸收峰红移，起到增色作用，对稳定性影响比较显著的辅色素为:对羟基苯甲酸、水杨酸钠和甘氨酸。通过单因素实验选取三者最佳浓度，然后采用三因素三水平响应面分析，依据回归分析确定最佳条件为:对羟基苯甲酸、水杨酸钠和甘氨酸添加的质量浓度分别为0.063%、0.041%和 0.039%，测得蓝靛果花色苷保存率为88.01%，而不加辅色素保存率仅为48.97%，稳定性提高了1.8倍，为蓝靛果花色苷天然色素的应用和发展提供了有利条件，有一定的开发利用价值。

另外，比较所有实验结果发现，对花色苷稳定性效果较好的三种辅色素位移数相同，推断可能是作用在花色苷上的位置相近，产生了一致或者类似结构，起到了对花色苷的保护作用，具体机制有待于进一步的研究分析。

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Effect of co－pigments on enhancing stability of anthocyanins from Lonicera edulis Turcz

ZHANG Zhi，SONG Jing，WANG Zhen－yu*，ZHAO Xin，WANG Yu－jia
(College of Forest，Northeast Forest University，Harbin 150040，China)

The technology for enhancing the stability of natural pigments was hard to breakthrough，which was the restrictive factor of development.The co－pigmentation of several kinds of organic acid，metals，carbohydrate or amino acids with anthocyanins from Lonicera edulis Turcz was detected in order to enhance stability of anthocyanins.The results indicated that para－hydroxybenzoic acid(PHBA)，natrium salicylicum(NaSA)and aminoacetic acid(Gly)made a hyperchromic effect and the absorption spectra of anthocyanins was bathochromic shifted，after continuous high temperature and illumination remained high preservation rate.The optimum concentration of the three kinds of co－pigments were firstly selected by single－factor experiment，then the optimum conditions was determined by the method of response surface analysis with three factors and three levels.The anthocyanins prepared by adding 0.063%PHBA，0.041%NaSA and 0.039%Gly(w/w)met the high preservation rate of 88.01%，compared to the anthocyanins prepared without co－pigments whose preservation rate was 48.97%，the stability had increased 1.8 times.This study was useful for the application and development of anthocyanins from Lonicera edulis Turcz.

Lonicera edulis Turcz;anthocyanins;co－pigmentation;stability;response surface

TS202.3

A

1002－0306(2011)04－0320－04

2010－04－15 *通讯联系人

张智(1964－)，女，博士，教授，研究方向:植物功能性生物转化、食品发酵。

哈尔滨市科技攻关项目(2008AA6AN087)。