保肾宁提取液对糖尿病肾病大鼠的防治作用

郭莹辉

(廊坊市人民医院内分泌科,河北 廊坊 065000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常见的微血管并发症,由DN引起的终末期肾病发生率逐年升高[1]。有研究证实,糖尿病肾病时肾组织细胞的过度凋亡与肾脏损害密切相关[2]。保肾宁方以糖尿病肾病阴虚燥热、伤津耗气、久病入络、瘀血阻滞、毒损脉络、脾肾亏虚的病机特点为基础,结合现代医学理论及临床经验而拟定,为了进一步验证其治疗作用,笔者观察了保肾宁提取液对糖尿病肾病大鼠肾脏细胞凋亡的影响,以探讨保肾宁提取液对DN大鼠肾脏防治作用的机制。

1 材料

1.1 实验动物

SD雄性大鼠50只,体质量180～200 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 药品及试剂

保肾宁提取液由黄芪、党参、女贞子、麦冬、葛根 、大黄 、茯苓 、丹皮、川芎、水蛭、鬼箭羽(均购自同仁堂药房,符合国家药典标准)组成,水煎醇提后浓缩至含生药3.15 g◦mL-1。贝那普利(商品名:洛丁新,北京诺华有限公司生产,规格:10 mg◦片-1),格列喹酮(商品名:糖适平,德国柏林格殷格翰国际公司与北京万辉药业集团合作制造,规格:30 mg◦片-1)。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司,兔抗Bax和Bcl-2单克隆抗体均为美国Calbiochem公司产品,TUNEL试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。

2 方法

2.1 造模、分组及给药

将50只SD大鼠适应性喂养1周后,随机抽取10只SD大鼠暴露右侧肾脏后缝合(为假手术组);其余40只行右肾切除术,2周后切口愈合,按50 mg◦kg-1腹腔注射 STZ(溶于 0.1 mol◦L-1、pH=4.5的枸椽酸钠缓冲液中),48 h后测血糖≥16.7 mol◦L-1,尿糖⧺～为成模[3]。40只SD大鼠成模35只,按随机数字表法选取30只分为模型组、西药组、保肾宁组3组,每组10只。给药方法:1)模型组:蒸馏水10 mL◦kg-1◦d-1);2)西药组:贝那 普利1.7 mg◦kg-1◦d-1+糖适平5 mg◦kg-1◦d-1;3)保肾宁组:保肾宁提取液0.1 mL◦kg-1◦d-1;4)假 手 术 组:蒸 馏 水10 mL◦kg-1◦d-1,各组均灌胃给药,时间8周。〛

2.2 检测方法

1)血、尿生化指标测定:用日立7071A全自动生化分析仪测定。2)流式细胞术检测:操作流程按试剂盒标明的方法进行。蛋白表达定量分析按照O.Morkve等[4]提出的方法,以荧光指数(FI)表示其相对含量。FI=(样品蛋白表达的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/正常对照样品平均荧光强度,FI＞1.0为阳性表达,FI＜1.0为阴性表达。3)原位末端标记法(T UNEL):按试剂盒标明的方法进行,显微镜下观察,TUNEL阳性反应为细胞核呈棕褐色或棕黄色颗粒。肾小管细胞凋亡指数=100个肾小管的阳性细胞数/100个肾小管细胞总数;肾小球的凋亡指数用平均单个肾小球切面的阳性细胞数作为比较指标。

2.3 统计学方法

采用Excel软件及SPSS 10.0统计软件进行统计分析,实验数据用均数±标准差()表示,组间比较用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠血清生化指标比较

与模型组相比,西药组及保肾宁组大鼠血清BUN、Scr、Upro均明显降低(P ＜0.01),见表1。

表1 各组大鼠血清BUN、Scr、Upro比较

表1 各组大鼠血清BUN、Scr、Upro比较

*P＜0.01与假手术组比较;△P＜0.01与模型组比较。

组别 n BUN ρ/(mmol◦ L-1)Scr ρ/(μ mol◦ L-1)Upro(24 h)m/mg假手术组 10 3.96±0.25 69.74±6.78 3.33±1.74模型组 10 15.78±2.17* 192.42±7.56* 16.27±3.75*西药组 10 9.15±0.78*△ 98.64±11.84*△ 6.45±4.22*△保肾宁组 10 8.02±1.32*△ 96.53±9.65*△ 7.39±2.61*△

3.2 各组大鼠肾组织中Bcl-2、Bax表达比较

保肾宁组及西药组与模型组比较,可升高Bcl-2、降低Bax的平均光密度值(P＜0.01);保肾宁组在升高Bcl-2、降低Bax方面效果优于西药组(P＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肾组织中Bcl-2、Bax表达比较

表2 各组大鼠肾组织中Bcl-2、Bax表达比较

*P＜0.01与模型组比较;△P＜0.05与西药组比较。

组别 n Bcl-2/FI Bax/FI假手术组 10 1.01±0.12 1.00±0.11模型组 10 0.80±0.14 1.49±0.16西药组 10 1.05±0.11* 1.08±0.09*保肾宁组 10 1.14±0.15*△ 1.02±0.05*△

3.3 各组大鼠肾组织细胞凋亡情况比较

西药组及保肾宁组与模型组比较,均能明显降低肾小球及肾小管细胞凋亡指数(P＜0.01);保肾宁组在降低肾小管细胞凋亡指数方面明显低于西药组(P＜0.05),见表3。

表3 各组大鼠肾小球及肾小管细胞凋亡指数比较

表3 各组大鼠肾小球及肾小管细胞凋亡指数比较

*P＜0.01与模型组比较;△P＜0.05与西药组比较。

组别 n 肾小球细胞凋亡指数 肾小管细胞凋亡指数假手术组 10 0.04±0.12 3.88±0.15模型组 10 0.64±0.13 12.89±0.28西药组 10 0.40±0.15* 7.62±0.27*保肾宁组 10 0.29±0.09* 4.98±0.09*△

4 讨论

细胞凋亡就是细胞死亡,广义的讲,细胞凋亡可包括细胞坏死、溶解和程序性死亡等;狭义地讲,是指细胞程序性死亡[5]。DN早期机体通过细胞凋亡清除增生的多余细胞是有益的,但晚期凋亡细胞数往往与肾功能恶化程度成正比[6]。有报道证实糖尿病模型肾组织中细胞凋亡数较非糖尿病肾脏明显增多,并伴有凋亡相关基因的改变[7]。Bcl-2是一个基因家族,Bax是Bcl-2基因家族中的一个同源蛋白,Bcl-2主要功能是促细胞生存,延长细胞寿命,抑制细胞凋亡,Bax主要作用是促细胞凋亡,Bcl-2与Bax的比例对细胞凋亡有调节作用[6]。

糖尿病肾病属于中医学的“消渴”、“水肿”、“虚劳”的范畴,DN病机特点为本虚标实,本虚为气血阴阳、五脏亏虚,标实为血瘀、痰凝、湿阻、水停、浊毒内生等。笔者根据中医理论结合长期临床经验,以滋阴降火、化瘀泻浊、健脾益肾为大法,拟定保肾宁方。方中以黄芪、党参为君药,健脾益气,补气生津,配以女贞子、麦冬,益肾滋阴清热,加用川芎、水蛭、大黄等药以祛瘀血、水湿、浊毒之邪。有研究表明,黄芪具有扩管、降压、利尿作用,能增加肾血流量,反馈性的抑制肾素-血管紧张素系统,增加氧化物的代谢,达到改善肾功能的目的[8];鬼箭羽能够降低DN大鼠的血糖,同时使DN大鼠的高、低切变率下的全血黏度明显下降[9];丹参能有效地抑制梗阻性大鼠肾组织中血管紧张素转换酶的活性,减少血管紧张素Ⅱ含量,进而保护肾脏。

本研究结果发现,保肾宁提取液能够明显改善DN大鼠肾功能,降低24 h尿蛋白排泄率,保肾宁提取液对Bax/Bcl-2凋亡相关蛋白的调节及肾脏细胞凋亡的干预,可能是其保护肾脏的作用机制之一。

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[6]Sugiyama H,Kashihara N,M akino H,et al.Apoptosis in glomerular sclerosis[J].Kidney Int,1996,49:103-111.

[7]张艳玲,段惠军,郝文田,等.苯那普利对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡及 Bax和Bcl-2表达的影响[J].中华物理医学与康复杂志,2001,23(4):237-239.

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