东亚异蚤蝇及其携带白僵菌防治松墨天牛的研究

叶 斌, 曾宣利, 王国良

(浙江万里学院生物与环境学院,宁波 315100)

松材线虫病(Bursaphelenchus xy lophilus)是国际上公认的最具危险性、毁灭性,同时又较难控制的检疫对象[1-2]。在日本和中国,该病的自然传播主要借助羽化后的松墨天牛(Monocham us alternatus)成虫在补充营养或产卵时,将线虫通过取食或产卵传入健康松树而使其致病[3-6]。

目前各地采用如注射高效内吸性杀虫、杀线虫剂,加强检疫杜绝人为传播,清除、处理病木材和用生物防治方法防治媒介昆虫松墨天牛等综合治理措施治理松材线虫病。其中疫区通过有效地降低松墨天牛的种群密度达到明显减少松树枯死率,成为防治的主要措施之一。由于松林环境条件和松墨天牛钻蛀为害的特性,采用生物防治方法,如用多种方法喷洒白僵菌(Beauveria bassiana)和释放寄生性天敌昆虫哈氏硬皮肿腿蜂(Sclerodermusharmandi)[我国过去误订为管氏肿腿蜂(Scleroderma guani)]、花绒寄甲(Dastarcus helophoroides)等取得了好的效果。由于林间松墨天牛幼虫不形成排粪、排气孔,蛀道充满木屑、粪便,多种方法喷洒的白僵菌孢子不易接触到松墨天牛幼虫而侵入,明显影响防效。采用虫菌结合方法,如将白僵菌的分生孢子附着在松墨天牛幼虫的寄生蜂肿腿蜂和某些松林中共生微小昆虫如黄色梢小蠹(Cryphalus fulvus)等虫体上后,把这些微小昆虫放入林间寻找天牛分布的病死木,让带菌的微小昆虫去感染松天牛,能明显提高效果[7-10]。

2007年和2008年作者在调查饲养松墨天牛时发现,有蚤蝇(Megaselia sp.)寄生松墨天牛幼虫,引起松墨天牛幼虫死亡并繁殖出许多蚤蝇。国内报道[11]蚤蝇对落叶松毛虫寄生率达55%,对舞毒蛾达20%,对天幕毛虫达89.7%,对落叶松毛虫越冬代2～3龄幼虫的寄生率可达64.28%,对控制落叶松毛虫的虫口密度,起到一定的作用。国外利用寄生性蚤蝇防治检疫性害虫红火蚁有较多报道。寄生性蚤蝇也叫断头蝇[12],主要是 Pseudacteon tricuspis,它将鱼雷形的单卵产于红火蚁的后胸,在寄生后的第4天就能在红火蚁的头部发现2龄若虫。蚤蝇生活史中大部分时间在红火蚁的头壳里度过,最后,蚤蝇从红火蚁的口器位置钻出完成羽化。蚤蝇作为红火蚁微孢子虫病原载体可能起了重要作用[13]。本地为了防治松材线虫病,采用多种方法喷洒白僵菌已经应用多年,但是效果不理想。为了提高松墨天牛的生物防治效果,近2年作者对该蚤蝇和利用其携带球孢白僵菌防治松墨天牛进行了一系列的研究,以期探索松材线虫病防治的新途径。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

蚤蝇来自2008年作者在调查饲养松墨天牛时发现的寄生在松墨天牛幼虫上的实验室越冬种群,采用长、高、宽均为60 cm的饲养箱,用冷冻猪腿肉作饲料全年饲养[14],建立实验种群供各项试验使用。

1.1.1 种类鉴定

将饲养过程中得到的蚤蝇各虫态,参照相关文献[15-16]作出初步鉴定。

1.1.2 蚤蝇的生活史、繁殖力与扩散力

生活史试验于2009年4-11月在浙江万里学院微生物研究所实验室(自然室温)进行。各虫态发育和繁殖观察于2010年5-6月进行。试验时在饲养箱内放入10头将羽化的蛹和2个诱卵皿(90mm培养皿,每个培养皿内放入2 g猪腿肉片和5m L自来水),每天更换1次诱卵皿。每天观察5次,记录产卵、幼虫生长、化蛹和羽化等过程。另外同时解剖10头刚羽化雌成虫的腹部,用实体解剖镜观察怀卵量。

扩散能力研究试验设在宁波市高教园区的大绿化区(南北2 000m左右,东西1 500m左右,以草坪和绿化树木为主,内有河流和道路)内。在释放蚤蝇成虫前1 d,用猪腿肉片+敌百虫引诱皿诱杀自然条件下的其他蝇类。

试验时在中心点放置1个释放瓶(允许蚤蝇成虫从瓶盖侧面的小洞钻出),内装200头将羽化蚤蝇蛹,离中心点南北方向 100、200、300、400m 各放 1个引诱皿(90 mm培养皿内放入5 g猪腿肉薄片和10 m L自来水),每天更换1次引诱皿,共 3 d,带回室内,体视显微镜下检查各点引诱皿内蚤蝇的卵粒数。得出该蚤蝇在平原草坪上的扩散能力和特点。

1.2 球孢白僵菌MA 0813菌株的毒力

1.2.1 繁菌方式与毒力

球孢白僵菌菌株MA 0813分离于北仑区病死松树中自然白僵的松墨天牛幼虫上。繁菌方式分为“虫菌”(菌株MA 0813涂接于越冬后松墨天牛4～5龄幼虫25 d后形成的白僵虫上的孢子),“PPDA菌”(菌株接种在PPDA培养基上25 d后产生的白僵菌孢子)和“商品菌”(盐城市神微微生物科技有限公司生产白僵菌孢子粉)。接种方法:用小号狼毫毛笔蘸取不同繁菌方式的白僵菌孢子,涂抹越冬后的松墨天牛4～5龄幼虫背部。接种孢子量的计算:将毛笔蘸取的白僵菌孢子在含0.2%吐温-80的无菌水中稀释、振荡后,用血球计数板计数,求平均值。各处理的平均接种孢子量分别为:虫菌1,10.2×104孢子/头;虫菌 2,5.1×104孢子/头;PPDA 菌 1,10.2×104孢子/头;PPDA 菌 2,5.1×104孢子/头;商品菌,10.2×104孢子/头。

每天观察1次,24 d后根据观察数据计算接种后松墨天牛幼虫的死亡率、僵虫率,以时间(d)的对数为x,死亡率的几率值为y,采用几率值分析法,计算毒力回归方程和致死中时(LT50)。试验数据应用DPS数据处理系统进行统计分析[17]。

1.2.2 染菌量与毒力

试验采用虫菌繁殖法获得的菌株MA 0813孢子,接种浓度为高浓度5.05×106孢子/m L,低浓度0.51×106孢子/m L。接种方法:用移液枪吸取一定量的菌液滴涂越冬后的4、5龄松墨天牛幼虫背部。试验共设:高5(高浓度 5μL)、高 3(高浓度3μL)、低10(低浓度10μL)、低5(低浓度5μL)、低3(低浓度3μL)和空5等6个处理。空5处理滴涂0.2%吐温-80的无菌水5μL作为空白对照。每天观察1次,观察22 d,获得的结果用DPS数据处理系统进行统计分析,分别得出LD50,毒力回归方程和致死中时(LT50)等[17]。

1.2.3 染菌方式与毒力

试验在室内养虫箱中进行,共设4个处理,每处理30头越冬后的4龄、5龄松墨天牛幼虫。每头幼虫放入瓶盖钻有2mm大小洞孔的5 m L塑料离心管内。

放菌蝇法:养虫箱中同时放入装有松墨天牛幼虫的塑料离心管和菌蝇瓶。菌蝇瓶内放入150头将羽化的蚤蝇蛹,菌蝇瓶瓶盖经特殊设计,羽化后蚤蝇必须钻过有2层白僵松墨天牛幼虫块的白僵菌层,达到携带白僵菌分生孢子的目的。捕获10头钻出菌蝇瓶的蚤蝇,放入0.2%吐温-80的无菌水中振荡、稀释后,用血球计数板测量蚤蝇携带白僵菌分生孢子的数量。放蝇法:方法同菌蝇法,但瓶盖内没有白僵菌层。撒菌粉:用单层纱布包1 g白僵松墨天牛幼虫块,在松墨天牛幼虫离心管上方20 cm处振荡10次。对照:放入松墨天牛幼虫,不作其他处理。30 d后检查各处理松墨天牛幼虫僵死情况。

1.3 防治松墨天牛低龄幼虫试验

1.3.1 对松树段内松墨天牛低龄幼虫防效试验

2010年6 月,从山上砍取生长正常,直径4～5 cm,长50 cm松树段和1年生嫩枝,在实验室内供松墨天牛成虫取食和产卵,到松树段上有多处松墨天牛低龄幼虫(1龄、2龄)为害状和排出的木屑时,松树段两端包尼龙薄膜后放入养虫箱中进行试验。试验采用放菌蝇法,养虫箱内放入的菌蝇瓶有300头将羽化的蚤蝇蛹,30 d后劈开松树段,检查松树段内松墨天牛幼虫僵死情况。

1.3.2 林地防治松墨天牛低龄幼虫效果试验

试验于2010年7月10日,在东钱湖白岩山灵峰庙下的林地中进行。试验只设放菌蝇法(同上述)和对照。对照设在离试验区1 000 m的森林中。试验时每隔大约100 m,在离地1m的树干上用胶带纸粘贴上1个菌蝇瓶(内放入150～200头将羽化的蚤蝇蛹),共放10个,15 d后再放1次。8月25日在试验区中砍取生长衰弱或松墨天牛虫幼虫为害状明显的松树,劈开松树段,检查松树内松墨天牛幼虫寄生僵死百分率。

2 结果与分析

2.1 蚤蝇形态特征及种类鉴定

成虫体长1～2 mm,胸背部隆起呈驼背状,胸部背板黄褐色或褐色,侧板黄色。中侧片具毛,无鬃,背侧鬃2根,小盾片鬃2对。腹部背板黑色至黑褐色,腹面后几节气门异常大。翅略呈灰褐色,翅脉黑褐色,翅无横脉,径脉粗壮,近翅的中部与前缘脉愈合,中脉细弱,斜伸过翅面。足黄色,腿节侧扁,后足腿节末端色暗,前足跗节细长,后足腿节基部的腹缘毛长于腹缘端部的腹缘毛;胫节缺前背纤毛,后背纤毛强壮。卵细长,底部平,呈船形。幼虫白色,头部尖,无长尾。蛹黄色或红褐色,前端背部具一对羽化板,在每个板状结构上各生一个呼吸角。初步鉴定为东亚异蚤蝇(Megaselia spiracularis Schmitz)。

2.2 东亚异蚤蝇年生活史与繁殖

年生活史:从2009年4月21日出现越冬代成虫到11月15日幼虫全部化蛹止,全年发生10代,以蛹越冬。各代时间为:第1代,4月下旬-5月下旬;第2代,5月下旬-6月上旬;第3代,6月上旬-6月下旬;第4代,6月下旬-7月上旬;第5代,7月上旬-7月下旬;第6代,7月下旬-8月上旬;第7代,8月上-8月下旬;第8代,8月下旬-9月中旬;第9代,9月中旬-10月中旬;第10代,10月中旬-11月中旬,为越冬代。

图1 东亚异蚤蝇特征

成虫羽化后当天便交尾产卵。雌雄成虫在飞行中交尾。卵多产于相对干爽的食物表面和培养皿接近水面的壁上,多为10～20粒聚在一起。雌虫平均产卵45粒。解剖雌成虫平均怀卵量35.3粒,幅度17～51粒。卵期很短,在室温(平均温度23℃)条件下,10～24 h内孵化。幼虫期4～6 d。1～2龄幼虫多聚在一起取食,进入3龄后期,便开始迁移,寻找隐蔽场所化蛹。蛹开始为淡黄色,之后逐渐变暗,直至成为红褐色。化蛹2～3 d后形成一对呼吸角。经过3～5 d,成虫破壳而出。成虫活动敏捷,做“停走”式运动,并开始交尾、产卵。成虫期在日均温28～29℃时只有1 d,日均温25℃时1～2 d,日均温20℃时2～3 d。

诱卵皿诱卵情况:第1天 69粒,第2天121粒,第3天35粒。其中最多1个诱卵皿有卵91粒,6～7 d后有84头发育为老熟幼虫,表明1 g猪腿肉片可以繁殖40头以上的幼虫。

2.3 东亚异蚤蝇扩散能力

东亚异蚤蝇在平原草坪上的扩散能力和特点见表1。该蚤蝇活动能力强,飞行扩散能力超过400m,但是就近产卵趋势十分明显,100 m处引诱皿中产卵量占总产卵量的72.30%,200m处引诱皿中产卵量占总产卵量的16.74%,2处诱卵量占总诱卵量的89.04%。

表1 东亚异蚤蝇的飞行扩散能力

2.4 繁菌方式与白僵菌毒力的关系

繁菌方式与白僵菌毒力测定结果见表2。结果表明,白僵菌繁菌方式与其对松墨天牛幼虫的毒力明显有关,用松墨天牛幼虫繁殖的球孢白僵菌MA 0813菌株2种接种浓度,僵死虫率都为100%,LT50分别为9.81 d和13.79 d。PPDA上培养MA0813菌株只在高浓度时才有理想效果,接种量为10.2×104孢子/头的僵死虫率为100%,但是其LT50为17.22 d,比虫菌相同接种量处理慢了7 d多,而PPDA菌接种量5.1×104孢子/头的效果不理想。

2.5 染菌量与毒力

不同孢子浓度和接种量接种越冬后的松墨天牛幼虫试验结果见表3。球孢白僵菌MA 0813菌株滴涂法的毒力回归方程为y=8.04+3.63x,R=0.986 5。LD50=(0.145 5±0.110 5)万孢子/头,95%置信区间0.033 8万～0.239 6万孢子/头。LD95=(0.412 8±0.101 9)万孢子/头,95%置信区间0.260 5万～0.511 6万孢子/头。

表2 球孢白僵菌不同繁菌方式对越冬后松墨天牛幼虫的毒力

表3的结果说明,滴涂高浓度孢子液(5.05×104孢子/m L)5μL和3μL处理的僵死虫率都为100%,LT50分别为10.39 d和11.77 d,两者没有明显区别,但是两者LT90有明显差别。而滴涂低浓度孢子液(0.51×104孢子/m L)10μL处理的僵死虫率96.7%,同滴涂高浓度孢子液的2个处理效果接近,而与滴涂低浓度孢子液5μL和3μL的处理有明显区别。将表2中虫菌2处理的数据同表3中高3处理的数据比较可以发现,同一菌株,同一繁菌方法,两处理的僵死虫率都为 100%,LT50虫菌2处理为13.79 d,高3处理的11.77 d,但是接种的菌量和方法不同,高3处理滴涂孢子液1.5×104孢子/头,虫菌2处理涂孢子粉5.1×104孢子/头,两处理接种的孢子量为1∶3.4,表明滴涂孢子液处理的毒力明显高于涂孢子粉处理。

表3 球孢白僵菌MA0813菌株不同孢子浓度、数量对越冬后松墨天牛幼虫的毒力

2.6 染菌方式与毒力

经对10头钻出菌蝇瓶的蚤蝇携菌量进行测定,放菌蝇法中每只蚤蝇平均携带白僵菌分生孢子数量为1.02×105孢子/头。

不同染菌方式处理越冬后松墨天牛幼虫的校正僵死虫率分别为:放菌蝇法53.3%;放蝇法13.3%;撒菌粉23.3%;对照0%。表明3种染菌方式都有一定的效果,其中放菌蝇法在菌蝇与松墨天牛幼虫数量比为 5∶1条件下,校正僵死虫率达到53.3%,明显高于放蝇法和撒菌粉及两者之和。

2.7 防治松墨天牛低龄幼虫试验

2.7.1 对松树段内松墨天牛低龄幼虫效果

30 d后劈开松树段,检查松树段内松墨天牛1～2龄幼虫僵死情况,结果(表4)表明,在室内条件下,每养虫箱内放入300头将羽化的蚤蝇蛹(菌蝇与松墨天牛低龄幼虫数量比大约为4～5∶1)时,3种方法对松树段内松墨天牛低龄幼虫都有效果,其中放菌蝇法的校正僵死虫率达到46.40%,明显高于放蝇法和撒菌粉及两者之和。撒菌粉法的校正僵死虫率为21.85%,明显高于放蝇法。

表4 不同染菌法对松树段内松墨天牛低龄幼虫的效果1)

2.7.2 林地防治松墨天牛低龄幼虫试验结果

试验区共砍取生长衰弱或松墨天牛幼虫为害状明显的松树4株,共检查到松树内松墨天牛活幼虫56头,白僵虫37头,死虫4头。松墨天牛低龄幼虫僵死率为37.3%。对照区共砍取松树2株,检查到活幼虫43头,白僵虫1头,白僵虫百分率2.4%。试验结果初步表明,7月上中旬在山林中每隔大约100 m,放150～200头菌蝇2次,能够提高松墨天牛低龄幼虫僵死率达35%。

3 讨论

刘广纯等[14-16]对东亚异蚤蝇各虫态的形态特征进行了描述。东亚异蚤蝇以猪腿肉片饲养在宁波全年发生10代,以蛹越冬。在平均温度24℃室温条件下,11～15 d完成1代。人工饲养、繁殖十分容易,平均1 g猪腿肉片可以繁殖40头以上的幼虫。

研究发现,繁菌方式与白僵菌对松墨天牛幼虫的毒力明显有关。接种浓度相同时,用松墨天牛幼虫繁殖的白僵菌比PPDA上培养的白僵菌对松墨天牛幼虫LT50约少7 d。说明虫菌法繁殖的白僵菌毒力远高于其他方法。

本试验发现东亚异蚤蝇成虫寿命很短,夏天日平均温度在28～29℃时只有1 d,日平均温度在25℃时只有1～2 d。本地松墨天牛低龄幼虫发生期为6月下旬到9月上旬的高温季节,所以作者认为在实际防治应用时可以不考虑该蚤蝇与白僵菌有无毒力关系。

防治松材线虫病需要面对山林环境条件和松墨天牛钻蛀为害特性,生物防治是最主要方法之一。寄生性天敌昆虫哈氏硬皮肿腿蜂,在林间当代扩散半径达50 m左右,寄生率平均为31.2%,3个月后蜂群在林间扩散半径达150 m左右,寄生率提高到25.0%～46.1%[18-19]。但是人工繁殖多代的哈氏硬皮肿腿蜂在自然条件下活力不高是个难题。在林间多种方法喷洒的白僵菌孢子不易接触到松墨天牛幼虫而侵入,从而影响防效。采用虫菌结合方法能明显提高效果[7-10]。甘玉英等[20]在松墨天牛幼虫初期采用剥皮喷菌小蠹携传法(林间选择有小蠹虫的死树,将其伐倒,剥开树皮,并把所有的内皮朝上,用喷雾法把菌液均匀喷洒在死树皮上,使小蠹成虫全部染菌),达到防治松墨天牛幼虫的目的。该法对松墨天牛幼虫当代校正寄生率达41.53%,明显高于喷雾法的26.74%。本研究采用放菌蝇法,7月上中旬在山林中每隔大约100 m,在离地1m的树干上用胶带纸粘贴上1个菌蝇瓶,先后放 2次,松墨天牛低龄幼虫校正僵死率达35%。相比之下,放菌蝇法更方便、更省工,适合工厂化生产和大面积推广、应用。在推广、应用前,对放菌蝇的时间、次数、距离和菌蝇与松墨天牛比例等有待进一步探明。

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