N，N′-二环己基-N-二十二碳酸酰脲解离常数测定△

刘全军,邝晓聪,王闻楚,莫德欢,秦箐*

(1.广西医科大学药学院天然药物化学教研室，广西 南宁 530021；2.广西医科大学基础医学院病理生理学教研室，广西 南宁 530021)

化 学

N，N′-二环己基-N-二十二碳酸酰脲解离常数测定△

刘全军1,邝晓聪2,王闻楚1,莫德欢1,秦箐1*

(1.广西医科大学药学院天然药物化学教研室，广西 南宁 530021；2.广西医科大学基础医学院病理生理学教研室，广西 南宁 530021)

目的：测定N，N′-二环己基-N-二十二碳酸酰脲解离常数。方法：采用紫外分光光度法及A-pH曲线法测定N，N′-二环己基-N-二十二碳酸酰脲解离常数。结果：紫外分光光度法测得N，N′-二环己基-N-二十二碳酸酰脲的pKa为7.16±0.24，A-pH曲线法求得pKa为6.98。

N，N′-二环己基-N-二十二碳酸酰脲；解离常数；紫外分光光度法；A-pH曲线法

N，N′-二环己基-N-二十二碳酸酰脲(DCHDU)为从板蓝根中发现的板蓝根高级不饱和脂肪酸为先导化合物合成的新化合物，完成了抗肿瘤及免疫调节定量构效关系(QSAR)的研究，从中筛选出的一个新化合物，经免疫调节[1-3]及抗肿瘤[4]作用机制的研究显示，化合物DCHDU在免疫调节及抗肿瘤方面更属于结构新颖的化合物，已申请相关专利。本文测定了化合物DCHDU的解离常数，是对该化合物理化常数的补充，并为化合物DCHDU进一步药学研究的开展提供依据。

解离常数常用的测定方法有电势法、分光光度法[5,6]、电导率法、毛细管电泳法等。本实验采用分光光度法测定了化合物DCHDU的解离常数。

1 材料

1.1 仪器与试剂

TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，FE20pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，AL204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。DCHDU(自制，纯度>99%，GC测定)；其他试剂为分析纯；水为双蒸水。

1.2 缓冲液配制

称取KH2PO42.443 8 g，KC1 27.924 6 g加入双蒸水溶解后定容为1 L，取恒定离子浓度溶液(KH2PO4浓度为0.025 mol·L-1，μ=0.4)30 mL，滴加NaOH溶液(0.1,0.2 mol·L-1)，制得系列不同pH缓冲液。

2 方法与结果

2.1 测定方法的选择

DCHDU在甲醇溶液中在212 nm处有最大吸收峰，其紫外吸收光谱见图1。

图1 DCHDU紫外吸收光谱

分别以不同pH值的缓冲液为空白参比，在200～400 nm对DCHDU的不同pH值缓冲液进行紫外扫描其紫外吸收光谱，见图2。

图2 不同pH缓冲液中DCHDU紫外吸收光谱

结果显示pH 3.23～5.00 DCHDU的紫外吸收光谱行为一致，可认为pH在5.00以下DCHDU呈分子状态；在pH 10.57～11.26，DCHDU的紫外吸收光谱行为也一致，即完全呈解离状态；而在pH 6.46～8.15的各种缓冲液中DCHDU存在不同的分子型和离子型。由于DCHDU在不同pH的缓冲液中的紫外吸收光谱存在较大差异，因此，可以利用分光光度法测定其解离常数。

2.2 测定方法

精密称取DCHDU 12.5 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。精密量取500 μL溶液(共14份)，分别置5 mL容量瓶中，加入不同pH缓冲液定容，制得供试品DCHDU的浓度为12.5 μg·mL-1，室温下测定供试品pH，并以相应溶剂为参比，测定各供试品溶液的吸光度。

2.3 测定波长选择

DCHDU的最大吸收峰位置随pH的变化发生转移，选择在220，227，234，240 nm等波长下，样品在离子状态吸光度随pH值的变化更为敏感，曲线变化更为明显，故选择这些波长对DCHDU的解离过程进行研究。

2.4 读数时间的选择

按照测定方法选取加入不同pH缓冲液的供试品，进行时间曲线扫描。结果见图3。

图3 不同pH缓冲液中DCHDU紫外吸收时间扫描图

表明DCHDU在不同pH缓冲液下，其吸光度随时间逐渐增大，在离子和分子结构同时存在的情况下其增大速度要快于只存在离子或分子的状态，可能与酸碱条件下导致酰脲结构不稳定有关。因此，选择在溶液配制后5 min内读数。

2.5 测定结果及pKa的计算

按照上述测定方法，不同pH值供试品溶液分别在220，227，234，240 nm处测定吸光度，见表1。将表1中在同一波长的pH 6.16(AHR)、pH 10.57(AR-)及二者之间pH值(A)所测得的吸光度值代入公式pKa=lg(A-AR-)/(AHR-A)+pH，计算得pKa值，结果见表2。

表1 不同pH值DCHDU的吸光度

注：n=3

表2 DCHDU的解离常数

2.6 A-pH 曲线法作图求pK值

根据公式pKa=lg(A-AR-)/(AHR-A)+pH，当A=(AHR+AR-)/2时，所对应的pH值即为pKa。在230 nm波长处测得DCHDU的吸光度，以A-pH作图，得图4所示曲线，以A=(AHR+AR-)/2点向横坐标做垂线，求得DCHDU的解离常数pKa为6.98。

图4 234 nm处DCHDU的A-pH曲线

3 讨论

酸碱解离常数(pKa)是药物重要的ADME(吸收，absorption；分布，distribution；代谢，metabolism；及排泄，excretion)性质之一，药物的许多重要性质都与pKa有着密切的联系。比如解离常数(pKa)与药物穿过细胞膜的过程有相关性，这对药理研究和新药开发都具有重要意义。

用紫外分光光度法测定物质的pKa时，无需知道供试液中物质的准确浓度，只要求各供试液中物质的浓度相等，但物质的解离常数受缓冲体系、离子强度和有机溶剂的影响。本文选择磷酸盐缓冲体系并固定离子强度，因无水乙醇会使缓冲体系发生改变，故选用甲醇，以降低误差。

[1] 秦箐，贺海平，Soren Brogger Christensen，等.中药板蓝根中高级不饱和脂肪酸的分离鉴定及免疫活性成分的研究[J].中国现代医学杂志，2001，11(1)：15-16.

[2] Yongzhi Wang , Qing Qin, Jibing Chen, et al. Synergistic effects of Isatis tinctoria L. and tacrolimus in the prevention of acute heart rejection in mice[J]. Transplant Immunology, 2009, 22: 5-11.

[3] Kong X , Chen J, Qin Q, et al. Isatis tinctoria L. combined with co-stimulatory molecules blockade prolongs survival of cardiac allografts in alloantigen-primed mice [J]. Transplant Immunology, 2010, 23: 34-39

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[5] 刘西京，杨大坚，罗洁英，等.紫外分光光度法测定葛根素的解离常数[J].时珍国医国药，2006，17(11)：2206-2207.[6] 余 陈，何正标，王 敏，等.双波长分光光度法测定有机弱酸弱碱的解离常数[J].分析科学学报，2007，23(4)：401-404.

DeterminationofDissociationConstantofN,N′-Dicyclohexyl-N-DocosanoylUrea

LIU Quan-jun1, Kuang Xiao-cong2, Wang Wen-chu1, Mo De-huan1,Qin Qing1

(1.Dept.ofNaturalProductsChemistry,SchoolofPharmaceuticalSciences,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China; 2.Dept.ofPathophysiology,SchoolofPreclinicalSciences,GuangxiMedicalUniversity,Nanning, 530021,China)

Objective: To determine the dissociation constant of N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea.Methods: The dissociation constant of N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea is detected by ultraviolet spectrophotometry(UV) and A-pH curves.Results: The dissociation constant of N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea is 7.16±0.24 by UV and 6.98 by A-pH curves.

N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea; Dissociation constant; Ultraviolet spectrophotry; A-pH curves

国家自然科学基金资助项目(30560186)，广西科技厅广西科学基金项目(桂科自0728128)，2007年广西研究生教育创新计划项目，广西科技厅广西科学基金项目(桂科自0991147)

*秦箐，E-mail：qqyx103@163.com

2010-12-01)