HPLC测定注射用夏天无总碱中比枯枯灵的含量△

黄云，李文莉，龙海燕，肖艳萍，林海*

(1.湖南食品药品职业学院，湖南 长沙 410014；2.湖南省药品检验所，湖南 长沙 410001；3.湖南医药工业研究所，湖南 长沙 410014)

质 量

HPLC测定注射用夏天无总碱中比枯枯灵的含量△

黄云1，李文莉2，龙海燕2，肖艳萍3，林海2*

(1.湖南食品药品职业学院，湖南 长沙 410014；2.湖南省药品检验所，湖南 长沙 410001；3.湖南医药工业研究所，湖南 长沙 410014)

目的：建立HPLC测定注射用夏天无总碱中比枯枯灵的含量。方法：采用Polaris C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-0.1 %三氟醋酸(24∶76)为流动相，检测波长为225 nm。结果：比枯枯灵在0.006～0.09 μg与峰面积线性关系良好，平均加样回收率为100.7 %，RSD=2.06 %。结论：本方法灵敏度高，分离度良好，可用于测定注射用夏天无总碱中比枯枯灵的含量。

高效液相色谱法；注射用夏天无总碱；比枯枯灵

夏天无总碱为从夏天无中提取的有效成分群，总碱中以原阿片碱含量最高，其次为延胡素乙素、巴马汀、比枯枯灵、紫堇碱、球紫堇碱、罂粟碱等[1,2]。注射用夏天无总碱为夏天无总碱的冻干制剂，具有通络、活血、止痛的功效。用于高血压偏瘫、小儿麻痹后遗症、坐骨神经痛、风湿性关节痛、跌打损伤等。药理毒理实验预试表明，比枯枯灵具有显著的致惊厥作用，且其小鼠静脉注射LD50为0.9 mg·kg-1，而夏天无总碱小鼠静脉注射LD50为21.3 mg·kg-1。为保证夏天无总碱临床使用中的安全性，本文研究建立了注射用夏天无总碱中比枯枯灵的高效液相色谱测定方法，并对10批样品进行了测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters1525+Waters717；色谱工作软件：Empower；检测器：Waters2996 PDA检测器；Mettler AE-240电子天平；超声波清洗仪 CG-300(300 W，25 kHz)。

1.2 试药

重蒸馏水；乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。注射用夏天无总碱，规格：2 mg/瓶(湖南医药工业研究所，批号：20020210，20020213，20020321，20020329，20020416，20020426，20021020，20021026，20021103，20021112)。比枯枯灵对照品(湖南省药品检验所中药室)，经过结构确证，面积归一化法进行纯度检查结果为99.49 %。阴性样品自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

VARIAN色谱柱Polaris C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1 %三氟醋酸(24∶76)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为225 nm；柱温为35 ℃。

2.2 检测波长的选择

精密称取比枯枯灵对照品5.00 mg，置10 mL量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得比枯枯灵储备溶液(0.5 mg·mL-1)；精密量取储备溶液1 mL置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(5 μg·mL-1)。照《中国药典》(一部)2000年版附录V A分光光度法试验，以流动相为空白，取对照品溶液在200～500 nm扫描(扫描速度：中速，狭缝：1.0)。结果比枯枯灵对照品溶液在205.2、225.0 nm波长处有最大吸收；而205.2 nm波长属末端吸收，故选用225 nm为检测波长，见图1。

图1 比枯枯灵对照品溶液UV图

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的配制 精密吸取前述比枯枯灵储备溶液(0.5 mg·mL-1)3 mL，置250 mL量瓶中加流动相至刻度，摇匀，即得(6.0 μg·mL-1)。

2.3.2 供试品溶液的制备 取注射用夏天无总碱(批号：20021128)5瓶的内容物，研细，取约0.1 g，精密称定，置25 mL量瓶内，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 阴性样品溶液的制备 取辅料0.1 g，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

精密吸取上述比枯枯灵对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性样品溶液图谱中，在比枯枯灵保留时间(约7 min)处无色谱峰出现，表明阴性样品对比枯枯灵的测定无干扰，见图2。

A.比枯枯灵对照品 B. 注射用夏天无总碱 C.阴性样品图2 注射用夏天无总碱样品及对照品HPLC图

2.4 线性关系考察

精密吸取比枯枯灵对照品溶液(6.0 μg·mL-1)各1，3，5，7，10，15 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以比枯枯灵峰面积积分值为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，计算，得回归方程Y=4 637 434.023×C-3 082.29,r=0.999 95。比枯枯灵进样量在0.006～0.09 μg与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(批号：20021128)，进样6次，每次5 μL，测定，其比枯枯灵峰面积积分值的RSD=1.2 %，结果表明精密度良好，分离度1.9，理论板数不低于2 000。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液(批号：20021128)，分别在0，3，6，28，35 h进样1次，测定比枯枯灵峰面积积分值,RSD=1.8 %，表明供试品溶液在35 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取同一批号(批号：20021128)样品共5份，按前述供试品方法制备，依法测定，比枯枯灵平均含量为0.085 8 mg·g-1，RSD=0.96 %,表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量(批号：20021128,含量为0.085 8 mg·g-1)的样品约0.05 g,共5份，精密称定,置25 mL量瓶中，加流动相10 mL,振摇使溶解,各分别精密加入比枯枯灵对照品溶液(0.9 mg·mL-1)10 mL，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液5 μL，注入高效液相色谱仪，计算回收率，结果见表1。

2.9 样品测定

按前述方法对10批注射用夏天无总碱中比枯枯灵含量进行测定，测定结果见表2。

表1 比枯枯灵对照品回收率试验

注：比枯枯灵对照品加入量均为4.32 mg

表2 10批注射用夏天无总碱中比枯枯灵含量测定 mg/支

3 讨论

3.1 流动相的选择

参照有关文献[3-5]，配制以下流动相：(1)乙腈-甲醇-0.2 %磷酸(15∶10∶75)，(2)甲醇-醋酸/醋酸钠缓冲液(pH 5.0)(75∶25)，(3)甲醇-水-二乙胺-浓氨溶液(50∶50∶0.8∶0.4)，(4)乙腈-0.1 %三氟醋酸(24∶76)。在上述色谱条件下，流动相(1)、(4)均可获得较理想的高效液相色谱图，比较流动相(1)、(4)，三氟醋酸黏度比磷酸小，因此采用流动相(4)乙腈-0.1 %三氟醋酸(24∶76)。

3.2 提取方法的考察

本试验根据不同提取时间采用回流提取法、超声提取法、振摇法等多种方法进行考察，回流法和超声法提取含量基本接近，故采用超声法操作方法简单。

[1] 国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册[M].北京：人民卫生出版社，1986：860，1035，130，800，801，153，318，712.

[2] 黄云，肖艳萍，李娟，等.夏天无有效成分的分离和确证[J].湖南中医杂志，2005,21(4)：81-82.

[3] 李晓蒙，刘映，廖华卫.高效液相色谱法测定夏天无中原阿片碱和延胡索乙素的含量[J].中成药，2002，24(3)：208.

[4] 王栋,宁雅君,伍雪涛,等.用HPLC法测定夏天无制剂中原阿片碱和延胡索乙素的含量[J].药物分析杂志，1991，11(5)：296.

[5] 顾孝红，唐平，靳祖英.反相高效液相色谱法测定夏天无中原阿片碱的含量[J].时珍国医国药，2002，13(10)：608-609.

DeterminationofBicucullineinTotalAlkaloidsofCoryadlisAmbailisMigoPowderInjectionbyHPLC

HUANG Yun1，LI Wen-li2，LONG Hai-yan2，XIAO Yan-ping3，Lin Hai2

(1.HunanFoodandDrugVocationalCollege，Changsha410014，China；2.HunanInstituteforDrugControl，Changsha410001，China；3.HunanInstituteofPharmaceuticalIndustryResearch，Changsha410014，China)

Objective： To establish the method for determining the content of Bicuculline in total alkaloids of Coryadlis ambailis migo by HPLC.Methods： Using Polaris C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)as analytical column， with acetonitril-trifluoroacetic acid(24∶76)as mobile phase， detection wavelength at 225 nm.Results： The calibration curve was linear in the range of 0.006～0.09 μg of bicuculline. The average recovery was 100.7 %. and related standard deviation(RSD)was 2.06 %.Conclusion: This method with high sensitivity and resolution can be used to determine the content of bicuculline in total alkaloids of Coryadlis ambailis migo powder injection.

HPLC; Total alkaloids of Coryadlis ambailis migo; Bicuculline

湖南省科技支撑重点项目(2006TP2005)

*林海，Tel：(0731)82275840，E-mail：hailin171@yahoo.com.cn

2010-12-08)