不同柑橘品种耐冷内生菌的分离与初步鉴定

刘卫今, 蒋向辉, 黄 勇, 殷 妮

(怀化学院11生命科学系; 2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室; 31湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室,湖南怀化 418008)

不同柑橘品种耐冷内生菌的分离与初步鉴定

刘卫今1,2,3, 蒋向辉1,2,3, 黄 勇1, 殷 妮1

(怀化学院11生命科学系; 2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室; 31湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室,湖南怀化 418008)

柑橘内生菌资源很丰富,柑橘的冻害与病害的防治及果实品质跟内生菌有很大关系1通过对8个不同柑橘品种的组织表面消毒和耐冷处理,采用稀释涂布平板法与划线分离法,从中分离出8种耐冷内生菌1运用传统的分类鉴定方法,对分离到的耐冷内生菌进行了革兰氏染色、芽孢染色、运动性检查,得到了各耐冷内生菌的相关特征1

柑橘; 耐冷内生菌; 分离与鉴定

近几年来,植物内生细菌应用于植物病害防治方面的研究逐渐深入,已成为植物病害生物防治的主要药源之一[1]1植物内生细菌不仅将植物作为其栖息场所,而且对寄主植物有促生、防病、内生联合固氮等广泛的生物学作用,是植物病害生物防治、内生联合固氮菌筛选、诱导抗病性及转基因载体等功能的天然菌源,具有较高的理论研究价值和实际应用价值,已成为微生物学和植物学学科的研究热点1孔庆科等[2]认为:感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势,比未感染植株更具生存竞争力1在内生菌-植物宿主-食草动物生态系统中,植物内生菌扮演着前所未知的重要生态学作用1发挥这些作用的物质基础是内生菌产生的丰富多样的次生代谢产物,它们具有多种生物活性,在农业和医药业中具有重要的应用潜力1有关研究结果表明柑橘内生细菌资源丰富,而且多数对植物病原真菌具有一定的拮抗作用,可作为生物防治的资源进一步用于防病和保鲜1郑重禄等[3]的有关试验虽然初步筛选出对柑橘炭疽病具有防治作用的内生菌,但对其定殖性和可用于防病保鲜的商品应用价值仍然有待深入研究1

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

在湖南省麻阳县园艺场的柑类、橙类、柚类中选8个代表种,即柑、脐橙、沙塘桔、金钱橘、沙田柚、血橙、葡萄柚、冰糖柑1

1.2 实验方法

1.2.1 耐冷内生菌分离

1.2.1.1 培养基制备

分别制备牛肉膏蛋白胨培养基、LB液体培养基与固体培养基制备、高氏一号培养基1

1.2.1.2 取样

在2008年冰灾中耐冷性表现较好的柑橘园中,采用5点取样法(东、南、西、北、中),每点选取供试树1株,取2个健壮、外观漂亮且果体中等以上的果实作为分离材料,每个品种取样10个样本,将所采样本分种类分别装入食品保鲜袋内带回实验室1

1.2.1.3 预处理

取果实进行组织表面清毒,即用75%的酒精浸泡1 min,再用011%的升汞溶液浸泡5 min,无菌水洗3次,晾干,放入冰箱中经耐冷处理10 d之后从冰箱中取出,再进行表面消毒1实验中设立对照:吸取少量表面消毒中最后一次冲洗材料的无菌水,涂布于培养基上,经培养若无微生物长出,表明表面消毒彻底1

取各品种柑橘6个经表面消毒后放入4℃冰箱中分别冷处理4、6、8、10、12、14d,取出后再次表面消毒,取中果肉分别培养在标号D4、D6、D8、D10、D12、D14的平板中,观察内生菌生长情况1

1.2.2 内生菌的纯化

在超净工作平台上切取果实的果皮,果肉(1 cm ×1 cm),分别装入高氏一号、LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基平板上,置于28℃恒温培养箱中培养,待边缘长出细菌后,挑取不同形态的菌落,进行培养1继而通过多次平板划线得到单个菌株以后移入试管斜面保存1

1.2.3 菌落形态特征的观察

将菌种接种于营养琼脂培养基,37℃培养48 h后,观察其在营养琼脂培养基上的生长情况,记录其菌落形态特征,再挑出菌株,进行革兰氏染色、荚膜观察、芽孢检查、运动性检查和需氧特征观察1

2 结果与分析

2.1 耐冷内生菌分离

2.1.1 耐冷时间

表1 各品种柑橘在不同冷处理时间的长菌情况

由表1可知不同柑橘品种冷处理的合适时间为:沙田柚和葡萄柚的冷处理14 d,其他柑橘品种的冷处理时间10 d较为合适1

2.1.2 不同分离方法效果比较

2.1.2.1 通过稀释涂布平板法得到的内生菌分别为:

2.1.2.2 通过划线分离法得到的内生菌分别为:

从脐橙中分离出2号细菌;从沙塘桔中分离出3号细菌;从沙田柚中分离出5号细菌;从血橙中分离出6号细菌;从葡萄柚中分离出7号细菌;从冰糖柑中分离出8号细菌1从表2的结果可知:稀释涂布平板法没有分离出3

表2 两种分离方法比较

号和5号,平板划线分离没有分离出1号和4号,单凭一种分离方法不能达到完全分离的效果,需经两种或两种以上的方法才能分离出理想的内生菌1

2.1.3 分离结果

表3 各种培养基分离结果比较

由表3可知,在牛肉膏蛋白胨培养基平板上没有分离出4号和7号菌株,在LB培养基平板上没有分离出2号菌株,高氏一号培养基没有分离到任何菌株,这说明各细菌所需的营养条件不完全相同1

2.1.4 同种细菌在不同培养基上的生长情况比较

表4 不同培养基中的生长情况

2、5、6、8号细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上长势明显好于LB培养基,菌落较后者大,生长速度快11、3、4、7号细菌在LB培养基中长势较牛肉膏蛋白胨培养基好,菌落较大,生长速度快1

2.1.5 在柑橘不同部位内生菌的存在情况

表5 在果皮与果肉中的情况

由表5可知在3号,4号,8号菌在果皮中没有出现,而在果肉中都有出现,原因可能是在样品表面消毒时果皮中内生菌已被杀死1

2.1.6 小结

本试验从经耐冷处理后的果皮与果肉中分离出8种内生细菌,内生放线菌的分离培养比较困难,没有分离出真菌和放线菌1

2.2 耐冷内生菌的鉴定

2.2.1 在营养琼脂平板上的生长情况

从菌株在营养琼脂平板上的生长情况可知各菌株的菌落形态特征(见表6),1号、2号、7号、8号菌株的菌落形态基本相同,都为乳白色,表面凸起,呈奶油状,边缘整齐,粘稠,但是1号,和7号,菌落半透明,而2号和8号菌落不透明13号和5号菌株的菌落都为乳白色,表面凸起,呈奶油状,边缘不整齐,其中3号,菌株的菌落不透明,不粘,较为干燥,5号的菌落半透明,粘稠,较为湿润14号和6号菌株的菌落都呈灰白色,表面凸起,半透明,边缘不整齐,4号和6号菌株的菌落表面都不光滑,4号表面为绒毛状,相对较为湿润,粘稠,6号表面为纤毛状,干燥,不粘,且边缘呈锯齿状1

表6 菌株在营养琼脂平板表面生长的菌落形态特征

图1 各菌株在LB琼脂培养基上的生长情况

2.2.2 菌株的形态结构特征

2.2.2.1 革兰氏染色结果

据图2可知:3号和6号中的菌体被染成红色,其余图中菌体为深紫色1可见从普通甜橙和血橙中分离出来的菌株为G-菌外,从柑、脐橙、金钱橘、沙田柚、葡萄柚和冰糖橙分离出来的菌株全为G+1在观察菌体的革兰氏染色情况时,还观察到一些为空泡状构造1从1号、3号、6号、7号和8号中观察到的空泡状构造为椭圆形;从2号中观察到的空泡状构造呈柱圆形;从4号中观察到的空泡状构造为圆形;从5号中观察到的空泡状构造为卵圆形1可见1号、3号、6号、7号和8号菌株能盐成的芽孢呈椭圆形;2号和4号菌株的芽孢呈柱圆形;5号菌株的芽孢呈卵圆形1

图2 各耐冷内生菌的革兰氏染色图

2.2.2.2 荚膜染色结果

通过荚膜染色后,可观察到1号、5号和8号菌株染色后可以观察到黑色的背景与红色的菌体之间衬托出了无色的一圈,镇1、5、8号菌株有荚膜,其他的菌株没有荚膜1

2.2.2.3 芽孢染色结果

从革兰氏染色结果中可以观察到芽孢的存在,在芽孢染色中,可以更清楚的观察到芽孢的形态特征1通过对芽孢染色装片的观察可知:1号、3号、7号和8号菌株有膨大的孢囊,在膨大的孢囊内有椭圆形的芽孢;2号菌株芽孢为柱形;4号菌株芽孢为圆形;5号菌株的芽孢为卵圆形;6号菌株芽孢为椭圆形1

2.2.2.4 运动性检查

通过运动性检查实验,可以观察到所有菌株的若干个菌体同时向不同方向运动,并且各运动菌体之间的距离不断发生变化,由此可见,从8中柑橘中分别分离出来的8种菌株都具有运动性1

2.2.2.5 需氧方式

1号菌株在厌氧培养基上沿穿刺线生长良好,上部和下部生长一致,呈线状;2号菌株在厌氧培养基上沿穿刺线生长良好,上下部生长一致,呈线状;3号菌株在厌氧培养基上沿穿刺线生长良好,上下部生长一致,呈线状;4号菌株在厌氧培养基上,仅表面生长良好,下部不生长;5号菌株在厌氧培养基上沿穿刺线生长良好,上部和下部生长一致,呈线状;6号菌株在厌氧培养基上沿穿刺生长良好,上部和下部生长一致,呈毛绒状;7号菌株在厌氧培养基上,仅表面生长良好,下部不生长;8号菌株在厌氧培养基上,仅表面生长良好,下部不生长;由于1号菌株、2号菌株、3号菌株、5号菌株、6号菌株在经穿刺的半固体培养基上,上、下部生长一致,则提示这些菌株可能是兼性厌氧菌;4号菌株、7号菌株和8号菌株在经穿刺的半固体培养基上,上部生长好,下部基本不生长,则提示这些菌株可能为专性好氧菌1

2.2.6 小结

根据以上实验结果,各耐冷内生菌形态特性总结如下表1

表7 各耐冷内生菌形态特性总结

运用传统鉴定方法鉴定(细胞形态、革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、运动性)得到了各耐冷内生菌形态特性特征,与《常见细菌系统鉴定手册》[4]所列的细菌菌株形态学和生理生化性状特征进行对比可知,从8种柑橘中分离出来的8种耐冷内生菌全都产生芽孢,为产芽孢细菌1由8种细菌在厌氧培养基中的生长情况可知此8种细菌为兼性厌氧菌或好氧菌,可知此8种细菌分别属于双芽孢杆菌属(Amphibacillus)盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicycobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、硫芽孢杆菌属(Sulfidobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)这8个属1

表8 初步鉴定结论

4 讨 论

4.1 关于内生菌分离方法

目前植物内生菌分离方法大多数采用常规表面消毒法,本研究为确保所分离到的微生物为植物体内生菌,采用的表面消毒比一般组织培养消毒更为严格,并对所消毒材料冲洗后的最后一次无菌水进行涂板培养,如在2～3 d内没有菌落产生,则认为该材料消毒彻底,证明所分离到的为内生菌1但用此消毒方法也易于杀死植物体内微生物,因而所分离到的内生菌种类与数量可能比植物体内所含的要少1在进行内生菌分离的过程中,掌握适宜的材料消毒时间对最终分离到的内生菌的数量和种类都具有重要作用1

耐冷时间的确定是根据各品种柑橘的果实大小,与果皮厚度不同来设的冷处理时间,冷处理的目的是从柑橘中筛选出优势的内生菌,以从一种柑橘中分离出1～2种内生菌为宜1不同分离方法达到的分离效果不完全相同,一种方法可能达不到完全分离的效果,该研究通过两种分离方法来进行分离,以达到互补的效果1

在内生菌的分离过程中,所用培养基均为常规分离用的培养基,因而不能保证所有生活在柑橘果实内的微生物全被分离出来,可能有的微生物不能在人工培养基上生长1耐冷内生菌在不同培养基中的生长情况不净相同,有的在牛肉膏蛋白胨培养基上长势良好,在LB培养基上长势较差,有的则在LB培养基中长势良好,在牛肉膏蛋白胨培养基上长势较差1这是因为各种细菌所需的营养条件不相同,从而导致这种现象的产生1本研究从经耐冷处理后的果皮与果肉中分离出8种内生细菌,内生放线菌的分离培养比较困难,没有分离出真菌和放线菌,具体原因有待进一步研究1 412 关于内生菌鉴定

传统的内生菌鉴定法以菌株的菌落形态(菌落颜色,表面特征……)、细菌形态、革兰氏染色、芽孢检查、荚膜染色等特征为依据来识别[5]1但由于传统鉴定方法存在项目众多、操作繁琐、需要分段进行、耗时长且存在一定的局限性等缺点,极有可能导致结果不准确,例如在培养基中不能形成孢子的真菌,必须采用其他方法进行检测和鉴定1并且内生菌长期处于共生生活中,会发生变异而失去典型特征,例如产生孢子的能力退化,只形成菌丝等,这样会导致其菌落形态等特征和典型菌株的差异存在[6],造成鉴定困难或结果不准确等1传统的分类鉴定不仅不能鉴定所有的内生菌,鉴定结果也肯可能出现一些偏差,虽然科技在不断进步,新的先进的鉴定方法也不断出现,但是传统的鉴定结果仍然是描述种属特征所必不可少的依据1

植物内生菌分布广,种类多,据何美仙[7]等人的研究表明内生菌可增强宿主对病原细菌和真菌的抗性,保护宿主免受危害,对植物的生长发育具有重要的作用,感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势,比未感染植株更具生存竞争力1在内生菌——植物宿主——食草动物生态系统中,植物内生菌扮演着前所未知的重要生态学作用1植物内生菌的研究正蓬勃地开展起来,有着广阔的发展前景,但在研究和应用的过程中也显现出了如用于生物防治使周围环境及植物体的微生态环境都对内生菌的生长和作用的发挥存在影响,使防治效果不稳定;能产生有医疗作用的活性物质的内生菌往往培养成本高,活性物质产量低等一些问题1而且,目前植物内生菌的作用机理的研究也有待深化1植物内生菌相对来说开发较少、次生代谢产物丰富,合理开发利用植物内生菌资源,从内生菌中寻找新的活性代谢产物,将成为今后研究的重点1

[1]刘云霞,张青文,周明胖,等.植物保护21世纪展望[M].北京:中国科学技术出版社,1998.

[2]孔庆科,丁爱云.内生细菌作为生防因子的研究进展[J].山东农业大学学报(自然科学版),2001,32(2): 256-260.

[3]郑重禄.柑橘防腐剂及其应用和发展方向[J].福建果树,1999,(2):27-29.

[4]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册(第一版) [M].北京:科学出版社,2001.

[5]王利娟,贺新生.植物内生真菌分离培养的研究方法[J].微生物学杂志,2006,26(4):55-60.

[6]戴传超,余伯阳.驱杀菜青虫的内生菌鉴定与化合物研究[J].安徽农业科学,2006,34(4):694-697.

[7]何美仙.植物内生真菌作为生防因子的研究进展[J].植物保护,2005,31(1):10-14.

Abstract:The endogenous bacteria resources is very rich inCitrus reticulataBlanco1,Citrus reticulataBlanco1disease control is closely related to the fruit quality,and have very big concern with endogenous bacteria1By surface sterilization and cold treatment,we isolated eight cold resistant endogenous bacteria,the result display the bacterial species in diffferentCitrus reticulataBlanco1were different1Based on the main shape of colony and individual,and the physiology and biochemistry character of bacteria,the species of eight cold resistant endogenous bacterias were identified1

Key words:Citrus reticulataBlanco1; Cold Endurance Endophytic; Isolation and Identification

Isolation and Identification of Cold Endurance Endophytic in DifferentCitrus ReticulataBlanco1Varieties

LIU Wei-jin1,2,3, JIANG Xiang-hui1,2,3, HUANG Y ong1, YINGNi1
(1.Department of Life Science; 2.Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources; 31Key Laboratory of Hunan Higher Education for Hunan-western Medicinal Plant and Ethnobotany, Huaihua University,Huaihua,Hunan 418008)

Q93-331

A

1671-9743(2011)02-0037-06

2011-02-13

湖南省教育厅资助项目(09C755);怀化学院资助项目(HHUY2008-12)1

刘卫今(1970-),男,湖南衡阳人,怀化学院副教授,主要研究微生物技术1