荧光光谱法研究橙皮素与牛血清白蛋白的相互作用*

尚永辉

（咸阳师范学院 化学与化工学院，陕西 咸阳712000）

科研与开发

荧光光谱法研究橙皮素与牛血清白蛋白的相互作用*

尚永辉

（咸阳师范学院 化学与化工学院，陕西 咸阳712000）

采用荧光光谱技术研究了橙皮素与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。研究发现橙皮素对BSA的荧光猝灭属于静态猝灭过程，由热力学参数焓变△r H m=-60.543 kJ·mol-1，熵变△r S m=-114.121J·mol-1均小于零,判断橙皮素与BSA之间主要靠氢键和范德华力相结合,生成自由能变(△r G m)为负值,表明橙皮素与BSA的作用过程是一个自发过程;并应用同步荧光光谱考察了橙皮素对BSA构象的影响。

橙皮素；牛血清白蛋白；荧光光谱

Abstract:The interaction behavior between Hesperetin and Bovine Serum Albumin(BSA)was studied by fluorescence spectroscopy.The quenching constants were obtained at 292K,299 K,311K and 315t K,the results indicated that the fluorescence quenching mechanism for BSA through Hesperetin binding is likely a static quenching process.The thermodynamic parameters,enthalpy change (△r H m)and entropy change(△r S m),were calculated to be-60.543 kJ·mol-1＜0,and-114.121J·mol-1＜0,respectively,which indicated that the interaction of Hesperetin with BSA was driven mainly by hydrogen bond and Van der Walls force.The process of binding was a spontaneous process in which Gibbs free energy change(△r G m)was negative.The effect of Hesperetin on the conformation of BSA was analyzed using synchronous fluorescence spectroscopy.

Key words:Hesperetin;Bovine Serum Albumin（BSA）;fluorescence spectroscopy

药物进入人体首先与血清白蛋白结合，通过血浆的存储和运输到达受体部位产生药理作用[1]。因此，从不同角度研究蛋白与药物分子间的相互作用已成为目前药物研究的热点问题之一。荧光光谱法是目前研究蛋白质与各种小分子以及离子相互作用的重要手段之一，通过研究，可获得蛋白质分子中荧光生色基团结构和所处微环境及其分布情况等信息，同时还可得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。

橙皮素（Hesperetin）属于双氢黄酮类化合物，能有效抑制脂肪分解，促进DNA生物的合成，具有健胃、祛痰、镇咳、利尿以及抗氧化、抗肿瘤等多种功效。实验在pH值为7.40的Tris-HCl介质中运用荧光光谱技术研究了橙皮素与BSA的相互作用，并对其作用机理进行了初步分析。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

牛血清白蛋白（Amresco.0930，分子量:65000）；橙皮素（中国药品生物制品检定所）；pH值为7.40的Tris-HCl缓冲溶液。

以Tris-HCl缓冲溶液分别配制浓度均为1.0×10-3mol·L-1的BSA和橙皮素标准溶液，两种标准溶液均在0～4℃的冰箱中保存。实验所需浓度由此稀释而得。实验所用其他试剂为分析纯；水为双重蒸馏水。

RF-5301型荧光分光光度计（日本岛津公司）;UV-8453紫外分光光度计（日本日立公司）；HA-180MF电子分析天平（日本日立公司）;TB-85型恒温水浴（日本岛津公司）；pHSJ-4A pH计（上海雷磁仪器厂）。

1.2 实验方法

在10mL比色管中依次加入pH值为7.40的Tris-HCl缓冲溶液 2.0mL、1.0×10-4mol·L-1BSA溶液1.00mL以及一定梯度量橙皮素标准溶液，采用双重蒸馏水稀释至刻线，摇匀，在一定温度下恒温1h后以285nm为激发波长绘制300～500nm的荧光发射光谱以及Δλ=60nm，Δλ=15nm的同步荧光光谱，测定测定中光谱带宽均为3nm。

2 结果与讨论

2.1 荧光猝灭光谱

按照 1.2 方法分别测定 292，300，310，315K 温度下橙皮素对BSA的荧光猝灭光谱，310 K的荧光光谱见图1。

图1 橙皮素对BSA荧光光谱的影响（T=310K）Fig.1 Fluorescence quenching spectra ofHesperetin-BSA(at310K)

由图1可知，随着橙皮素浓度的逐渐增加BSA的荧光强度逐渐降低，最大发射波长由340nm逐渐红移至350nm，这是由于BSA中的色氨酸和酪氨酸等残基使其具有一定的内源荧光，加入的外源性物质橙皮素与BSA之间产生相互作用导致BSA的内源荧光有规律的猝灭。

2.2 荧光猝灭机理及猝灭常数的测定

引起荧光猝灭的原因有动态猝灭和静态猝灭两种，随温度的升高动态猝灭过程猝灭常数增大，而静态猝灭过程猝灭常数减小，可由此判断荧光猝灭得类型。不同温度下橙皮素对BSA荧光猝灭方程（Stern-Volmer方程）及猝灭常数见表1。

表1 不同温度下橙皮素对BSA的猝灭常数Tab.1 Stern-Volmer quenching constantatdifferent temperatures

由表1可知，随温度升高猝灭常数逐渐减小，表明该猝灭过程是由于以静态猝灭为主。此外，各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数K q为2×1010L·（mol·s）-1[2]，橙皮素对 BSA 的 K q 远大于该值，进一步判断橙皮素对BSA的荧光猝灭过程以静态猝灭为主。

2.3 牛血清白蛋白与橙皮素结合反应的热力学性质及作用力

分子间的作用力包括氢键，范德华力，静电引力，疏水作用力等，根据文献[2]计算310、315K温度下橙皮素与BSA结合作用的热力学参数：自由能变△r G m=-25.166kJ·mol-1（310K），△r G m=-24.709 kJ·mol-1（315K），焓变△r H m=-60.543 kJ·mol-1，熵变△r S m=-114.121J·mol-1。△r G m＜0表明橙皮素与BSA的相互过程为自发进行，根据Ross等总结出的判断生物大分子与小分子结合力性质的热力学规律△r S m＜0，△r H m＜0推断橙皮素与BSA之间的作用力以为氢键和范德华力为主。

2.4 橙皮素与BSA的表观结合常数Kb以及结合位点数n

小分子与大分子结合时其表观结合常数Kb与结合位点数n由下式求出[5]:

lg[（F0-F）/F]=lg Kb+n lg[Q]

分别绘制橙皮素与 BSA 的 lg（F0-F）/F～lg[Q]的双对数图，根据方程的截距，斜率求得相应的Kb和n，见表 2。

表2 不同温度下，橙皮素与BSA的表观结合常数Kb以及结合位点数nTab.2 The binding constants Kband the binding numbers n of Hesperetin-BSA atdifferent temperatures

由表2可知，橙皮素与BSA结合时的结合位点数n接近1，结合常数Kb值在高于104数量级，表明橙皮素与BSA结合可形成具有1个结合位点，结合作用较强的非荧光复合物，橙皮素可以被蛋白质运输和储存。

2.5 同步荧光光谱

芳香氨基酸残基的最大荧光发射波长与其所处的环境极性有关，通过荧光发射波长的改变可判断芳香氨基酸残基所处微环境的变化，Δλ=15nm，60nm的同步荧光光谱分别显示酪氨酸残基，色氨酸残基的光谱特征[3]。固定BSA浓度为0.1×10-4mol·L-1逐步改变橙皮素的浓度绘制Δλ=15nm，Δλ=60nm的同步荧光光谱（图略），发现：酪氨酸和色氨酸残基的荧光强度均随着橙皮素浓度的增加而被猝灭，且荧光谱发射峰的位置均发生了微小的红移，表明橙皮素对酪氨酸残基，色氨酸残基微环境疏水性降低，亲水性增加[3]。此外色氨酸残基荧光峰发射峰与BSA的荧光发射峰位置相近，且色氨酸残基猝灭程度比酪氨酸残基更为显著，表明BSA的荧光主要由色氨酸残基所贡献，橙皮素与BSA的结合位点更接近于色氨酸残基。

3 结论

在pH值为7.40的Tris-HCl缓冲体系中采用荧光光谱技术研究了橙皮素与BSA的相互作用。结果表明：橙皮素对BSA的荧光猝灭过程属静态猝灭，结合过程是靠氢键和范德华力相结合的自发反应过程，应用同步荧光光谱考察了橙皮素对BSA构象的影响。

［1］胡艳军，刘义，侯安新.化学学报［J］.2004，62（16）:1519-1523.

［2］安道利，李建晴，智慧，分析科学学报［J］.2008，24（3）:311-314.

［3］杨曼曼，杨频，张立伟.科学通报［J］.1994，39（1）：31-35.

Study on the interaction between hesperetin and bovine serum album in by fluorescence spectroscopy*

SHANG Yong-hui
（School of Chemistry ＆ Chemical Engineering，Xianyang Normal University，Xianyang 712000，China）

O657.34

A

1002-1124（2011）01-0012-03

2010-11-30

国家自然科学基金项目（20975081）；陕西省教育厅科研计划项目（2010JK899）；西北大学研究生交叉学科资助项目（07YJC09）

尚永辉（1978-），男，陕西宝鸡人，硕士，讲师，2002年毕业于陕西师范大学分析化学专业，主要从事药物化学研究及教学工作。