准好氧矿化垃圾床处理渗滤液的脱氮菌群研究

张爱平，刘 丹，韩智勇，刘 咏

1.四川师范大学化学与材料科学学院，四川 成都 610068

2.西南交通大学环境科学与工程学院，四川 成都 610031

准好氧矿化垃圾床处理渗滤液的脱氮菌群研究

张爱平1，刘 丹2，韩智勇2，刘 咏1

1.四川师范大学化学与材料科学学院，四川 成都 610068

2.西南交通大学环境科学与工程学院，四川 成都 610031

为探明准好氧矿化垃圾床处理渗滤液的生物脱氮机理，采用最大或然数计数法以及一系列的生化试验和镜检照片，研究了床层不同高度脱氮菌的数量和菌群结构.结果表明:床内亚硝化菌、硝化菌、厌氧反硝化菌和好氧反硝化菌的平均数量分别为5.3×106，7.5×106，6.9×103和2.5×105g－1，亚硝化菌、硝化菌和好氧反硝化菌主要富集于反应床的表层和底部，厌氧反硝化菌主要富集于反应床的中部;从床内共分离出3株亚硝化菌，6株硝化菌，5株厌氧反硝化菌和6株好氧反硝化菌.准好氧矿化垃圾床处理渗滤液的生物脱氮机理为同步硝化反硝化，主要发生在反应床的表层和底部.

准好氧矿化垃圾床;渗滤液;亚硝化菌;硝化菌;反硝化菌

Abstract:A biologicalmechanism for nitrogen removal from leachate was investigated using a semi-aerobic aged-refuse bioreactor. The quantity and microbial community structure of denitrifier at various heights of the bioreactor were studied using the most probable number method，a series of biochemical tests and microscopic photos.The results showed that the average quantity of nitrosobacteria，nitrobacteria，anaerobic and aerobic denitrifying bacteria were 5.3×106，7.5×106，6.9×103and 2.5×105per gram，respectively.Nitrosobacteria，nitrobacteria and aerobic denitrifying bacteria were mostly found at the surface and bottom of the bioreactor，while anaerobic denitrifying bacteria were mostly at the middle.Finally，three strains of nitrosobacteria，six strains of nitrobacteria，five strains of anaerobic denitrifying bacteria and six strains of aerobic denitrifying bacteria were isolated from the bioreactor.Thus，the biologicalmechanism could be explained by simultaneous nitrification and denitrification，and its action zones were mainly presented at the surface and bottom of the bioreactor.

Keywords:semi-aerobic aged-refuse bioreactor;leachate;nitrosobacteria;nitrobacteria;denitrifying bacteria

填埋法是近年来应用较多的垃圾处理方式，截至2003年底，我国的垃圾填埋处理率接近83%［1］.垃圾在填埋过程中，会产生对公众健康、周围水源和生态环境构成极大污染威胁的高浓度渗滤液.渗滤液中的氨氮(NH3-N)有造成水体富营养化、破坏生态平衡等的危害，亚硝酸盐氮-N)和硝酸盐氮(-N)对水产动物、人体有一定的毒性［2-3］.随着石化、食品和制药等工业的发展以及人民生活水平的不断提高，垃圾渗滤液中NH3-N及其他形态氮化合物的含量急剧增加，因此，如何去除垃圾渗滤液中的氮污染物已备受关注.

由于填埋垃圾成分的差异，国外所采用的垃圾渗滤液脱氮技术在国内往往难以适用，因此当前研究适合我国国情的、有效的垃圾渗滤液脱氮方法显得尤为迫切.就国内垃圾渗滤液的处理现状而言，仍以常规的生物法、物化法、土地法等技术为主，但大多数技术存在处理成本高或脱氮效果不稳定等缺点.利用稳定化垃圾处理渗滤液是实现垃圾可持续填埋的一项新技术，具有投资省、操作简便、运行费用低等优点［4-7］.相关研究表明:稳定化垃圾处理渗滤液效果好，在一定运行条件下，CODCr和NH3-N去除率均可稳定在92%以上;但对总氮(TN)处理效果不理想，削减率普遍不足50%［8-10］.

该课题组曾利用稳定化垃圾填充准好氧生物反应床，对垃圾渗滤液进行一次过流处理试验.结果表明:生物脱氮效果理想，驯化结束后 CODCr，NH3-N和TN的去除率分别达97%，99%和91%以上，不存在-N 和-N 的积累现象［11-14］.为探明其脱氮的生物机理，对准好氧矿化垃圾床处理渗滤液时的亚硝化菌、硝化菌和反硝化菌的数量和类别进行了研究［15-21］，为优化准好氧矿化垃圾床的设计、提高城市卫生的管理水平、筛选垃圾渗滤液脱氮优势菌株、制定固定化微生物产品提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验装置

试验装置为由一个聚氯乙烯管模拟的准好氧生物反应床，其具体结构和尺寸如图1所示.反应床内填充埋龄为3年并已趋于稳定化的准好氧垃圾38 kg.

图1 准好氧矿化垃圾床结构示意图Fig.1 Sketch of the semi-aerobic aged-refuse bioreactor

1.2 样品采集

试验样品取自驯化结束后正常运行的准好氧矿化垃圾床.在反应床的表层、中部和底部(见图1)分别取样，共3份样品.对于每份样品，分别取5 g，移入无菌瓶中，瓶内装有含100 mL无菌蒸馏水和30颗玻璃珠，剧烈震荡30 min后取上层菌液供分析.

1.3 试验步骤

采用选择性液体培养基，根据最大或然数计数法对亚硝化菌、硝化菌、厌氧反硝化菌和好氧反硝化菌进行最大可能的计数.然后，采用选择性固体培养基，在分离和纯化菌株的基础上，依据菌株的形态特征、培养及生理特征、生化特征和美蓝染色的镜检照片，查阅文献［15，17］，对亚硝化菌、硝化菌、厌氧反硝化菌和好氧反硝化菌的菌株进行鉴定.试验期间，通过预埋电极的方法测得准好氧矿化垃圾床表层、中部和底部的氧化还原电位(Eh).

1.4 细菌计数

采用最大或然数计数法测定试样菌液中亚硝化菌、硝化菌、厌氧反硝化菌和好氧反硝化菌的数量，培养条件为28℃，培养时间为7～14 d.

亚硝化菌计数培养基:1 L蒸馏水加入2 g (NH4)2SO4，0.03 g MgSO4·7H2O，0.25 g NaH2PO4，5 g CaCO3，0.75 g K2HPO4，0.01 g MnSO4·4H2O，调节pH为7.2.

硝化菌计数培养基:1 L蒸馏水加入 1 g NaNO2，1 g Na2CO3，0.25 g NaH2PO4，1 g CaCO3，0.75 g K2HPO4，0.01 g MnSO4·4H2O，0.03 g MgSO4·7H2O，调节pH为7.5.

厌氧反硝化菌的计数培养基:1 L蒸馏水加入5 g柠檬酸钠，1 g KH2PO4，2 g KNO3，1 g K2HPO4，0.2 g MgSO4·7H2O，液体石蜡10 m L(培养前加入)，调节pH为7.2～7.5.

好氧反硝化菌计数培养基:1 L蒸馏水加入1 g KNO3，1 g KH2PO4，0.5 g FeCl3·6H2O，0.2 g CaCl2，1 g MgSO4·7H2O，8.5 g琥珀酸钠，调节pH为7.0.

1.5 细菌分离

通过选择性培养—挑菌—划线分离等步骤对亚硝化菌、硝化菌、厌氧反硝化菌和好氧反硝化菌进行分离，并由此获得单菌落，经反复纯化后，将单菌落接入斜面培养基上以备鉴定之用.

亚硝化菌分离培养基:1 L蒸馏水加入2 g(NH4)2SO4，2 g NaCl，0.4 g FeSO4·7H2O，1 g K2HPO4，0.5 g MgSO4·7H2O，5 g CaCO3，20 g琼脂粉(提纯)，调节pH为7.2.

硝化菌分离培养基:1 L蒸馏水加入 1 g NaNO2，2 g Na2CO3，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g NaCl，0.5 g K2HPO4，0.4 g FeSO4·7H2O，20 g琼脂粉(提纯)，调节pH为7.5.

厌氧反硝化菌分离培养基:1 L蒸馏水加入5 g柠檬酸钠，1 g KH2PO4，2 g KNO3，1 g K2HPO4，0.2 g MgSO4·7H2O，20 g琼脂粉，液体石蜡10 m L (培养前加入)，调节pH为7.2～7.5.

好氧反硝化菌初选培养基:1 L蒸馏水加入1 g KNO3，1 g KH2PO4，0.5 g FeCl3·6H2O，0.2 g CaCl2·7H2O，1 g MgSO4·7H2O，8.5 g琥珀酸钠，BTB(1%溴百里酚蓝溶于酒精)1 m L，20 g琼脂粉，调节pH为7.0～7.3.

好氧反硝化菌分离培养基:1 L蒸馏水加入0.6 g KNO3，1 g KH2PO4，1 g MgSO4·7H2O，2.4 g琥珀酸钠，20 g琼脂粉，调节pH为7.0～7.3.

1.6 细菌的鉴定

采用特殊染色法、平板分离技术，以及PYG增菌培养与产气、葡萄糖氧化发酵、精氨酸双水解酶、接解酶、氧化酶、脂酶、耐氧与需氧、二乙酰试验(V.P)、耐盐与耐酸、氨盐氧化、亚硝酸盐氧化和硝酸盐还原等一系列的生化试验，利用双目生物显微镜(XSP－2C，上海光学仪器厂)和倒置相差显微镜(TE2000S，Nikon)对美蓝染色的菌株进行镜检，进而获得细菌的形态特征、培养及生理特征、生化特征等.鉴定时，主要根据文献［15，17］确定试验项目，同时与部分模式菌和文献［18］所示的标准菌的详图进行比对，最终确定待检菌属的类别.

2 结果与分析

2.1 床内脱氮菌的计数

准好氧矿化垃圾床在进水ρ(CODCr)约为6 000 mg/L，进水量为0.5 L，进水周期为12 h和运行温度为30℃下，经 1个月驯化后，当进水ρ(NH3-N)平均值为810 mg/L时，出水ρ(NH3-N)最低降至8.85 mg/L，NH3-N去除率高达98.9%，表明渗滤液硝化处理的效果较好;当进水ρ(TN)为847.73 mg/L时，出水 ρ(TN)降至 121.71 mg/L，TN去除率约为85.6%，表明该反应床对渗滤液实现了较好的反硝化处理.此时床内不同填埋高度的亚硝化菌、硝化菌和反硝化菌在培养7～14 d后的数量如表1所示.

从表1可以看出:①床内富集有数量庞大的亚硝化菌和硝化菌，其平均数量分别达到 5.3× 106和7.5×106g－1，与较肥沃土壤的细菌总数相近，证实该反应床对渗滤液进行了较好的硝化处理;②床内厌氧反硝化菌和好氧反硝化菌的平均数量分别为6.9×103和 2.5×105g－1，总体上数量较大，这在一定程度上解释了反应床对渗滤液较好的TN处理效果;③亚硝化菌、硝化菌、好氧反硝化菌主要富集于准好氧矿化垃圾床的表层和底部，而厌氧反硝化菌主要富集于反应床的中部.这是因为，准好氧矿化垃圾床表层通过与空气接触自然复氧，床层中部依靠垃圾表层、导气管和下部导液管的扩散供氧，而床层底部依靠不满流导液管自然通风供氧，三者氧的补给方式导致了氧分压的差异，进而使好氧的脱氮菌呈现出表层和底部富集、厌氧的脱氮菌呈现出中部富集的特征，由此表明准好氧矿化垃圾床对渗滤液的生物脱氮作用主要在反应床的表层和底部完成.

表1 准好氧矿化垃圾床内脱氮菌的数量Table 1 Quantity of denitrifier from the semi-aerobic aged-refuse bioreactor

2.2 床内亚硝化菌的鉴定

从准好氧矿化垃圾床的表层、中部和底部各分离到1株共3株亚硝化菌，根据菌株的形态特征、培养及生理生化特征、镜检照片(见图2)，鉴定其均为硝化杆菌科的亚硝化球菌属，详见表2.

所分离的亚硝化球菌属是一类常见的亚硝化菌，专性化能自养，它们氧化氨为亚硝酸盐和固定CO2以满足能量和碳素的要求;这类细菌严格好氧，用氧作为最终电子受体.根据同步硝化反硝化生物脱氮的中间产物理论，这类细菌在将氧化为的过程中，会有一定的NO和N2O等氮氧化物气体逸出，这种现象可以解释床内总氮损失的部分原因.

图2 亚硝化菌菌株的镜检照片(400×)Fig.2 Microscopic photos of nitrosobacteria strains

表2 准好氧矿化垃圾床内亚硝化菌的鉴定结果Table 2 Determination of nitrosobacteria from the semi-aerobic aged-refuse bioreactor

2.3 床内硝化菌的鉴定

从准好氧矿化垃圾床共分离出6株硝化菌，其中表层、中部和底部各2株.根据菌株的形态特征、培养特征、主要生理生化特征和镜检照片(见图3)鉴定可知，分属硝化杆菌科的硝化杆菌属和硝化球菌属，详见表3.

所分离的硝化杆菌属是一类常见的硝化菌，专性化能自养，它们将亚硝酸盐氧化成硝酸盐并固定CO2以满足能量和碳素的要求;这类细菌严格好氧，用氧作为最终电子受体.所分离的硝化球菌属也是一类常见的硝化菌，专性化能自养，它们氧化亚硝酸盐成为硝酸盐和固定CO2以满足能量和碳素的需要;这类细菌严格好氧，用氧作为最终电子受体.

图3 硝化菌菌株的镜检照片(400×)Fig.3 Microscopic photos of nitrobacteria strains

表3 准好氧矿化垃圾床内硝化菌鉴定结果Table 3 Determ ination of nitrobacteria from the semi-aerobic aged-refuse bioreactor

通过在反应床内预埋氧化还原电极测得表层、中部和底部的Eh分别为318，211和235 mV，综合分析这些亚硝化菌和硝化菌的特征可知，由于这种好氧的环境有利于生长，从而使它们大量生长并富集，因而提高了反应床对渗滤液硝化处理的能力.

2.4 床内反硝化菌的鉴定

根据培养生长的不同氧环境，反硝化菌可分为厌氧反硝化菌和好氧反硝化菌两大类.对准好氧矿化垃圾床内不同填埋高度的反硝化菌分别在好氧、厌氧条件下进行培养，最终分离出5株厌氧反硝化菌和6株好氧反硝化菌.根据菌株的形态特征、培养特征、主要生理生化特征和镜检照片(见图4，5)对菌株进行鉴定，结果见表4，5.

图4 厌氧反硝化菌菌株的镜检照片(400×)Fig.4 Microscopic photos of anaerobic denitrifying bacteria strains

由表4，5可以看出:①经耐氧性试验测定，所分离的5株厌氧反硝化菌属兼氧型生长的菌株有3株，占厌氧反硝化菌总株数的60%;经需氧性试验测定，所分离的6株好氧反硝化菌属兼氧型生长的菌株有 5株，约占好氧反硝化菌总株数的83%.可见，床内反硝化菌以兼氧型为主，表明准好氧矿化垃圾床具同步硝化反硝化反应器这一典型的微生物学特征.②所分离的5株厌氧反硝化菌分别属于3个不同的属，即粪球菌属、葡萄球菌属和醋酸杆菌属;所分离的6株好氧反硝化菌分别属于6个不同的属，即葡萄球菌属、邻单胞菌属、链球菌属、微球菌属、气单胞菌属和假单胞菌属.

图5 好氧反硝化菌菌株的镜检照片(400×)Fig.5 M icroscopic photos of aerobic denitrifying bacteria strains

表4 准好氧矿化垃圾床内厌氧反硝化菌鉴定结果Table 4 Determination of anaerobic denitrifying bacteria from the semi-aerobic aged-refuse bioreactor

采用厌氧矿化垃圾床处理渗滤液的相关研究显示，反应床中细菌总数的变化范围为 0.85× 106～27.5×106g－1［21］.由于准好氧矿化垃圾床的自然通风供氧作用，其处理渗滤液中氮污染物的效果要明显优于厌氧矿化垃圾床，TN去除率提高了30%以上，原因在于准好氧矿化垃圾床内脱氮菌群的数量更为丰富，其数量级接近于厌氧矿化垃圾床内的细菌总数，鉴定结果同时证实床内存在大量的厌氧反硝化菌和好氧反硝化菌，保证了床内硝化反硝化作用的顺利进行.

反应床表层、中部和底部的Eh分别为 318，211和235 mV，均在200 mV以上，填埋的垃圾都处于好氧的宏观环境中，这也表明床内的自然通风供氧效果明显.厌氧反硝化菌的分离可从同步硝化反硝化的微环境理论予以解释，即由于矿化垃圾结构特征、微生物种群构成、基质分布代谢活动、生物化学反应的不均匀性以及物质传递的变化等因素的相互作用，导致即使在好氧的宏观条件下，仍可能存在厌氧的微环境类型.总体上，由于反应床的运行条件能满足大部分反硝化菌的生长要求，使它们良好生长并富集，进而促进好氧反硝化和厌氧反硝化作用尤其是好氧反硝化作用的顺利进行，最终提高了反应床同步硝化反硝化的脱氮能力.

3 结论

a.通过对脱氮菌计数发现，床内亚硝化菌、硝化菌、厌氧反硝化菌和好氧反硝化菌的平均数量分别为5.3×106，7.5×106，6.9×103和2.5×105g－1.其中，亚硝化菌、硝化菌及好氧反硝化菌主要富集于床内Eh较大的表层和底部，厌氧反硝化菌主要富集于床内Eh相对较小的中部.

b.脱氮菌的分离和鉴定结果表明，从床内分离到的3株亚硝化菌均为亚硝化球菌属，6株硝化菌分别属于硝化杆菌属和硝化球菌属2个属，5株厌氧反硝化菌分别属于粪球菌属、葡萄球菌属和醋酸杆菌属3个属，6株好氧反硝化菌分别属于葡萄球菌属、邻单胞菌属、链球菌属、微球菌属、气单胞菌属和假单胞菌属6个属.

c.基于床内脱氮菌的菌相分析和床内的Eh分析，准好氧矿化垃圾床处理渗滤液的生物脱氮机理为同步硝化反硝化，但有关反应床的宏观环境中氧的分布与控制，以及与之密切相关的微环境的形成过程与结构分析等问题，均有待深入研究.

致谢:感谢四川师范大学面上项目(10MSL03)的资助.

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Denitrifier Comm unity of Leachate Treated by Sem i-Aerobic Aged-Refuse Bioreactor

ZHANG Ai-ping1，LIU Dan2，HAN Zhi-yong2，LIU Yong1

1.School of Chemistry and Material Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610068，China

2.School of Environmental Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，China

X703

A

1001－6929(2011)01－0102－08

2010－08－19

2010－10－10

中央高校基本科研业务费专项资金项目(2010XS36)

张爱平(1979－)，女，浙江金华人，讲师，博士，主要研究城市垃圾处理与资源化，zap2002cn@sina.com.